氯化两面针碱对肺癌A549细胞凋亡及细胞周期影响的研究

摘要

背景和目的：
　　由于环境及生活方式的改变，肺癌的发生率逐年升高，目前已成为全世界急需攻克的难题。大部分患者在就诊时已处于进展期，使肺癌的五年生存率处于低水平。因此，我们急切寻找更多治疗肺癌的有效药物。近几年天然产品氯化两面针碱被认为具有抗肿瘤作用。已有多项实验证明氯化两面针碱对乳腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌等细胞具有抑制增殖作用，但尚未见对肺癌细胞作用的研究。本实验以肺癌A549细胞为研究对象，观察氯化两面针碱对其抑制作用并讨论相关机制。
　　1.观察氯化两面针碱对人肺癌细胞生长和增殖的影响；
　　2.观察氯化两面针碱对人肺癌细胞凋亡及细胞周期的影响，并探讨其机制。
　　方法：
　　1.不同浓度的氯化两面针碱作用于A549细胞，体外培养48h后，应用MTT法检测A549细胞的生长和增殖情况；
　　2.不同浓度的氯化两面针碱作用于A549细胞后，应用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡的形态学变化；应用 AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率，PI单染法检测各组细胞周期比例；应用Western blot方法检测各组细胞凋亡通路、Wnt通路及细胞周期相关分子的表达情况。
　　结果：
　　1.MTT结果显示，氯化两面针碱显著抑制A549细胞的增殖，其抑制增殖作用呈时间和剂量依赖性。单因素方差分析，各时间段内实验组与对照组比较，差异有统计学意义（**P＜0.05，***P＜0.01）；
　　2.应用Hoechst33258染色法，可见经氯化两面针碱处理过的A549细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状、块状荧光，形成大小不等、内含细胞器和细胞核的凋亡小体；
　　3.AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测结果显示，不同浓度的氯化两面针碱对A549细胞具有诱导凋亡作用，与对照组相比，差异具有统计学意义（*P＜0.05,**P＜0.01）；
　　4.PI单染法结果显示，经氯化两面针碱处理后的A549细胞，G2/M期细胞显著增多，呈剂量依赖性，提示氯化两面针碱具有阻滞细胞周期的作用；
　　5.Western blot检测结果显示，随着氯化两面针碱浓度的升高，A549细胞的凋亡通路相关分子Bcl-xl、Bid、PARP、p-β-catenin的表达水平下调；Cyto-C、β-catenin的表达水平上调；Caspase-9、Caspase-3、Caspase-8活性增强。提示氯化两面针碱能诱导A549细胞凋亡，呈剂量依赖性。细胞周期相关蛋白CyclinD1表达水平逐渐下调。提示氯化两面针碱可阻滞细胞周期，呈剂量依赖性。
　　结论：
　　1.氯化两面针碱可抑制肺癌A549细胞的生长和增殖；
　　2.氯化两面针碱可通过线粒体通路和死亡受体通路诱导肺癌A549细胞的凋亡，可能有Wnt/β-catenin信号转导通路的参与，并受Bcl-2蛋白家族的调节；
　　3.氯化两面针碱可阻滞肺癌A549细胞于G2/M期。

目录

声明

英文缩略词表

1、引言

2、材料

2.1实验室

2.2实验细胞株

2.3实验药品

2.4实验试剂

2.5试剂配制

2.6实验仪器及设备

3、实验步骤

3.1细胞复苏

3.2细胞传代培养

3.3细胞冻存

3.4细胞计数

3.5MTT实验检测细胞生存和增殖

3.6Hoechst33258观察细胞凋亡的形态学变化

3.7AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

3.8 PI单染流式细胞仪检测细胞周期

3.9Western blot检测蛋白的表达

3.10统计学方法

4、结果

4.1氯化两面针碱对A549细胞的增殖抑制作用

4.2氯化两面针碱对A549细胞凋亡的形态学变化的影响

4.3氯化两面针碱对A549细胞的诱导凋亡作用

4.4氯化两面针碱对A549细胞周期的影响

4.5氯化两面针碱对A549细胞凋亡通路相关分子表达的影响

4.6氯化两面针碱对A549细胞Wnt通路及细胞周期相关分子表达的影响

5、讨论

5.1氯化两面针碱对A549细胞的增殖抑制作用

5.2氯化两面针碱诱导A549细胞凋亡及初步机制

5.3氯化两面针碱通过Wnt/β-catenin信号通路诱导A549细胞的凋亡

5.4氯化两面针碱对A549细胞周期的影响

6、结论

参考文献

附录

致谢

综述:氯化两面针碱的药理作用及抗肿瘤作用机制研究进展