鼠疫耶尔森氏菌降解其分泌的鼠毒素研究

摘要

鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）引起的一种自然疫源性烈性传染病，历史上曾发生过三次人间鼠疫大流行引起数以亿计的人死亡，给人类带来巨大的灾难。鼠疫在我国被规定为甲类传染病，我国鼠疫自然疫源地分布广泛，占国土面积的15％左右，且疫区动物鼠疫流行面积不断扩大，人间鼠疫病例呈上升态势。此外，鼠疫菌又是一种生物战剂和恐怖剂，威胁着人类的安全。因此鼠疫的防治对人民健康安全、经济发展和社会稳定依然具有重要意义。
　　毒力完整的鼠疫菌含有三个毒力质粒（pCD1、pMT1、pPCP1），其中pCD1质粒被认为是鼠疫菌增殖扩散发挥毒力作用最主要的毒力质粒，其编码的T3SS将Yops蛋白“注射”到宿主细胞中，通过干扰细胞的正常生理功能、抑制免疫反应导致宿主死亡。pMT1质粒主要编码了鼠毒素，是鼠疫菌在跳蚤中肠生存形成菌栓的重要因素，在鼠疫菌传播中发挥重要作用。pPCP1质粒主要编码pla基因，Pla蛋白具有蛋白水解酶活性，并且可以降解Yops蛋白，是导致鼠疫菌高侵袭性的重要因素。故pMT1、pPCP1质粒在鼠疫菌传播和扩散的过程中也起到了非常重要的作用。在前期工作中，我们使用一株自内蒙古分离的布氏田鼠（Microtus brandii）型鼠疫菌201株，它含有pPCP1质粒、pCD1质粒、pMT1质粒和pCRY质粒。本室倪斌博士以鼠疫菌201株为母本，采用质粒无痕消除的策略，对4个质粒进行了不同程度的消除，获得了不同质粒缺失的突变株（201-pPCP1+pCD1+pMT1+、201-pPCP1+pMT1+、201-pPCP1+pCD1+、201-pCD1+pMT1+、201-pCD1+、201-pPCP1+、201-pMT1+、201-p）。
　　通过各质粒缺失株小鼠攻毒实验，我们发现高剂量下只含有pMT1质粒的菌株（201-pMT1+）对小鼠表现出异常的毒力，这与pMT1质粒不含重要的毒力因子的结论不吻合。通过对各质粒缺失株进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示所有含pMT1质粒的菌株（201-pPCP1+pCD1+pMT1+、201-pPCP1+pMT1+、201-pCD1+pMT1+、201-pMT1+）菌体中均有Ymt条带，其中含pMT1质粒且含pPCP1质粒的菌株（201-pPCP1+pCD1+pMT1+、201-pPCP1+pMT1+）的培养上清中检测不到Ymt条带，但可以检测到Ymt的降解片段；含pMT1质粒且不含pPCP1质粒的菌株（201-pCD1+pMT1+、201-pMT1+）的培养上清中可以检测到Ymt条带。一直以来Ymt被公认为是一种胞内蛋白，本实验首次在pPCP1质粒缺失株的分泌上清中检测到它，提示鼠疫菌分泌的Ymt可能在分泌过程中被pPCP1质粒所降解。
　　为了进一步探究Ymt蛋白是否是在分泌过程中被降解？被哪些基因降解？是否是直接降解？我们利用Red重组系统，采用一步法基因突变技术，构建了pla敲除株（201- pCD1+-pMT1+-pPCP1+-Δpla、201-pMT1+-pPCP1+-Δpla）；利用可以在鼠疫菌内复制，并且拷贝数与鼠疫菌质粒相近的pACYC184质粒，构建了pla回补株（201-pCD1+-pMT1+-pPCP1+-Δpla-pACYC184-pla、201-pMT1+-pPCP1+-Δpla-pACYC184-pla），基于构建成功的pla敲除株和pla回补株，将二者的分泌上清进行了SDS-PAGE电泳和WB验证，结果均显示敲除了pla的鼠疫菌（201- pCD1+-pMT1+-pPCP1+-Δpla、201-pMT1+-pPCP1+-Δpla）的分泌上清中可以检测到Ymt蛋白，而pla回补株（201-pCD1+-pMT1+-pPCP1+-Δpla-pACYC184-pla、201-pMT1+-pPCP1+-Δpla-pACYC184-pla）的分泌上清中检测不到Ymt蛋白，但可以检测到Ymt蛋白的降解片段，证明pPCP1质粒编码的pla降解了Ymt蛋白。为了进一步验证我们的发现，体外构建了BL21-pET28a-pla、BL21-pET28a-ymt获得体外表达纯化的Pla蛋白和Ymt蛋白，并对纯化后的Pla蛋白和Ymt蛋白进行了生物活性测定，证明二者均有活性。其中，重点测定了Ymt蛋白对小鼠的毒性，首次观察了纯化Ymt蛋白对小鼠脏器的病理学损伤。将纯化后的Pla蛋白和Ymt蛋白在离体37℃条件下孵育，孵育后的混合蛋白液进行SDS-PAGE电泳，结果显示混合蛋白液中只有Ymt蛋白没有Ymt蛋白的降解片段，故纯化后的Pla不能降解Ymt蛋白。我们将重组质粒pACYC184-pla导入到只含有染色体基因而不含质粒的鼠疫菌中构建重组菌株（P?-pACYC184-pla），将重组菌株（P?-pACYC184-pla）与纯化的Ymt蛋白37℃孵育，上清进行SDS-PAGE电泳。构建重组菌株（E.coli K12-pACYC184-pla、E.coli K12-pET28a-pla），重组后的菌株实验同上。SDS-PAGE电泳结果显示两株重组菌株与Ymt蛋白孵育后的上清中无Ymt条带，检测到Ymt降解片段，进一步证明在没有其他鼠疫菌质粒存在的情况下、无鼠疫菌菌体内参与的情况下，Pla蛋白可以降解Ymt蛋白。
　　本研究首次证明Ymt蛋白是分泌蛋白，并且Ymt蛋白在分泌过程中可以被pPCP1质粒编码的pla所降解。研究过程中没有检测到纯化后的Pla蛋白降解Ymt蛋白，我们推测可能是由于Pla降解Ymt还需要借助于其他因子，也可能是Pla蛋白需要特殊的空间结构才发挥作用，或者Pla降解Ymt蛋白存在一种特殊的机制。本研究结果为深入揭示鼠疫菌致病机制奠定了基础，也为鼠疫菌毒力进化的研究提供有力证据。

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前言

1 鼠疫的爆发、流行及危害

2 鼠疫菌的致病机制

3 鼠疫菌的毒力因子

4 本研究的目的和意义

5 本研究的内容

第一章 鼠疫菌pla缺失株互补株的构建和验证

1 引言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 结论

第二章 鼠疫菌Pla蛋白的体外表达纯化

1 引言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 结论

第三章 鼠疫菌Ymt蛋白的体外表达纯化

1 引言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 结论

第四章 鼠疫菌Pla蛋白与Ymt蛋白相互作用

1 引言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 结论

参考文献

附录

主要仪器

常用试剂及配制方法

个人简历

在学期间的研究成果目录

致谢

综述:鼠疫耶尔森菌重要毒力蛋白研究进展

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