结核杆菌耐热抗原对人肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌SP-B和凋亡的影响

摘要

背景及目的：现有对于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, M.tb）的研究主要是通过M.tb的自身成分或其分泌成分刺激诱导不同免疫细胞（DC细胞、γδT细胞等）来研究其相关作用机制，但对于抵御M.tb入侵肺部过程中发挥重要作用的肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar epithelial typeⅡcell, AT2）的研究还鲜见报道。已知临床上广泛使用的结核病（tuberculosis, TB）疫苗-卡介苗（Bacille-Calmette-Guerin, BCG）存在着对成人肺结核保护不稳定的不足，因此新靶向药物的研发也成为TB治疗的新研究课题。本实验研究从M.tb入侵人体肺部的重要屏障——AT2细胞为切入点，选用与 AT2细胞具有相同表型和特征的人肺腺癌细胞系（human lung adenocarcinoma cell line, A549）细胞，通过结核杆菌耐热抗原（Mycobacterium tuberculosis heat-resistant antigen, Mtb-HAg）刺激诱导A549细胞，探讨对A549细胞分泌肺泡表面活性物质相关蛋白B（pulmonary surfactant-associated protein B, SP-B）的作用和对其凋亡的影响。进而间接研究Mtb-HAg对AT2细胞分泌SP-B和凋亡的作用，为较好的研究肺部感染TB早期AT2细胞抵御M.tb入侵的机制提供新的理论依据；同时初步探究Mtb-HAg对AT2细胞的凋亡作用，为进一步深入研究其作用通路提供新的思路。
　　方法：（1）用含有10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和1%双抗的杜尔伯科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Media, DMEM）培养基，在37℃5%CO2恒温培养箱中培养A549细胞；用DMEM培养基稀释成不同浓度的Mtb-HAg工作液，分别刺激诱导A549细胞培养24 h,48 h，同时设置对照组。（2）采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）法分别检测空白对照组1、阳性对照组（脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激诱导培养24 h）和实验组1（不同浓度的Mtb-HAg分别刺激诱导培养24 h,48 h）的培养上清中SP-B的表达量。（3）使用实时荧光定量 PCR（real time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR）法分别检测空白对照组1、阳性对照组（LPS刺激诱导培养24 h）和实验组1（不同浓度的Mtb-HAg分别刺激诱导培养24 h,48 h）中目的基因SFTPB的相对表达量变化。（4）运用流式细胞技术（flow cytometry, FCM）分别检测空白对照组2、阳性对照组（姜黄素刺激诱导培养24 h）和实验组2（不同浓度的Mtb-HAg分别刺激诱导培养24 h）的细胞凋亡率变化。
　　结果：（1）与空白对照组1相比，诱导培养相同时间，阳性对照组（LPS组）和实验组1（不同浓度Mtb-HAg刺激诱导培养相同时间）的SP-B表达量显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；实验组1（相同浓度Mtb-HAg刺激诱导培养不同时间）的SP-B表达量降低不明显（P>0.05）。（2）相同培养时间，实验组1（不同浓度的Mtb-HAg刺激诱导培养）和阳性对照组（LPS组）中基因SFTPB的相对表达量均低于空白对照组1，差异具有统计学意义（P<0.05）；而在相同的Mtb-HAg优势刺激诱导浓度下，实验组1基因SFTPB的相对表达量随时间变化不显著，差异无统计学意义（P>0.05）。（3）阳性对照组（姜黄素组）的A549细胞凋亡率高于空白对照组2，差异具有统计学意义（P<0.05）；实验组2中A549细胞的凋亡率均与空白对照组2相比，均显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；但实验组2之间A549细胞的凋亡率变化不显著（P>0.05）。
　　结论：（1）Mtb-HAg对AT2细胞的体外模型A549细胞的SP-B分泌和其表达SP-B的基因SFTPB的表达具有抑制作用，从而有利于更好的研究AT2细胞在M.tb侵入人体肺部初期时发挥作用的机制。（2）Mtb-HAg可以诱导A549细胞发生凋亡，为M.tb的Mtb-HAg对于人AT2细胞的凋亡作用机制研究提供新的途径。

目录

声明

中英文缩略词对表

1前言

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1 结核杆菌耐热抗原和A549细胞的来源

2.1.2使用的主要试剂

2.1.3 主要的试剂配制

2.1.4 使用的主要仪器设备

2.2.1 A549细胞的冻存与复苏

2.2.2 ELISA法检测各组A549细胞培养上清SP-B的表达量

2.2.3实时荧光定量PCR法检测基因SFTPB的相对表达量

2.2.4流式细胞技术检测Mtb-HAg对A549细胞凋亡的作用

2.3统计学分析

3结果

3.1 A549细胞培养上清中SP-B的表达量

3.2 A549细胞中目的基因SFTPB的相对表达量

3.3 Mtb-HAg刺激诱导A549细胞凋亡的作用

4讨论

5结论

参考文献

附录

致谢

综述:气道上皮细胞在结核杆菌感染中作用的研究进展