沉默HK2基因表达对乳腺癌MDA-MB231细胞放疗敏感性影响的体外研究

摘要

目的：
　　本实验利用乳腺癌体外细胞模型，探讨短发夹RNA（shRNA）介导的己糖激酶2（hexokinase2, HK2）基因沉默是否对乳腺癌细胞的放疗敏感性和放疗效果有影响。通过慢病毒介导的RNA干扰技术构建己糖激酶-2（HK2）低表达的稳定的乳腺癌MDA-MB231细胞株，然后利用构建的稳定细胞株观察利用shRNA干扰技术使HK2基因表达水平降低与乳腺癌细胞MDA-MB231放射治疗敏感性之间的关系。
　　方法：
　　利用慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）干扰技术设计3个沉默HK2的shRNA基因序列（h-HK2 shRNA1、h-HK2 shRNA2、h-HK2 shRNA3）以及一个阴性对照序列(Negative shRNA)，将3沉默序列及一个阴性对照序列分别与质粒连接，然后转染人293T细胞，将靶基因植入慢病毒载体，随后转染乳腺癌MDA-MB231细胞系，通过抗生素嘌呤霉素筛选获得HK2低表达的乳腺癌MDA-MB231细胞系。采用RT-PCR及western blotting方法分别从mRNA和蛋白水平检测转染后的沉默效果。筛选出沉默效果最佳的稳定细胞株用于后续实验，后续实验分为3组：空白组（Control组，即不做任何处理），阴性对照组（Negative组，即转染阴性质粒组）以及沉默的实验组（HK2 shRNA组，即转染稳定沉默HK2基因质粒的实验组）。
　　1、将上述三组不同的细胞分别置于0、2、4、6、8Gy剂量的X线下照射，通过CCK-8实验观察三组细胞在上述不同剂量下的细胞增值情况。
　　2、将上述三组细胞在6Gy剂量的X线下照射，然后利用流式细胞术（FCM）检测三组细胞在6 Gy X线照射下细胞的凋亡情况。以此来判断沉默HK2与乳腺癌细胞MDA-MB231放射治疗敏感性之间的关系。
　　结果：
　　1、成功构建带有沉默HK2基因序列pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro的质粒。
　　2、RT-PCR及 western blot结果显示：三个沉默 HK2的序列中，h-HK2-shRNA1基因序列沉默的效果最好，沉默后HK2的mRNA相对表达量下降了89%。
　　3、三组细胞分别在0、2、4、6、8Gy的 X线照射后，三组细胞的存活率在同一个剂量下h-HK2-shRNA1组要明显低于Control组和Negative组(P<0.05)；并且，随着照射剂量的逐渐增高，三组细胞的存活率也逐渐下降，且 h-HK2-shRNA1组下降的幅度更大。
　　4、流式细胞术结果显示：三组细胞在6Gy的X线照射下，凋亡率分别为Control组（29.1%），Negative组（29.4%）和 h-HK2-shRNA1组（59.9%），可以看出h-HK2-shRNA1组的细胞凋亡率明显高于其余两组，且P<0.05。
　　结论：
　　利用慢病毒介导的RNA干扰技术有效的降低的乳腺癌细胞中HK2的表达水平，并成功的构建了带有沉默HK2基因序列的质粒，进而感染乳腺癌MDA-MB231细胞株，得到稳定转染HK2的乳腺癌细胞株。通过放射治疗后，沉默细胞组增值率明显下降，凋亡率明显升高，说明 HK2与乳腺癌的放疗敏感性有关，沉默 HK2可增加乳腺癌对放射治疗的敏感性。

目录

声明

英文缩略词表

1.前言

2.材料和方法

2.1材料

2.2实验方法

3统计学处理

4 结果

4.1 重组慢病毒载体质粒pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro的构建与测序

4.2 稳定MDA-MB231细胞系的构建

4.3稳定的MDA-MB231细胞HK2基因沉默建立的验证

4.4 CCK-8实验检测不同剂量放疗后细胞的存活率

4.5 Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测实验结果

5 讨论

5.1 RNA干扰技术

5.2慢病毒载体介导的RNA干扰技术

5.3沉默HK2表达对乳腺癌细胞放射敏感性的影响

5.4沉默HK2对乳腺癌MDA-M231凋亡的影响

5.5不足和展望

6.结论

参考文献

附录

致谢

综述:HKⅡ在恶性肿瘤中的作用极其机制