褪黑素在治疗挤压综合征动物模型缺血再灌注损伤的效果研究

摘要

背景及目的:褪黑素（melatonin，MEL）及其代谢产物具有很强的自由基清除能力，在哺乳动物各组织器官的缺血再灌注损伤过程中具备潜在的治疗作用。挤压综合征（crush syndrome，CS）是指各种重力创伤使肢体骨骼肌遭受持续性挤压，当这种持续性挤压解除后相应肢体骨骼肌出现的缺血及再灌注损伤，并引起横纹肌溶解、高钾血症、代谢性酸中毒、急性肾损伤等临床症状。挤压综合征多发生在战争灾害、恐怖袭击、地震、山体滑坡等灾害性事件中。缺血再灌注损伤是挤压综合征病理生理改变的使动环节。缺血再灌注过程中大量形成的氧自由基、炎症因子释放不仅影响局部组织活性及功能，还会引起全身炎症反应综合征(Systemic inflammation reaction syndrome,SIRS)，因而会继发心脏、肾脏、肺等远隔器官的损伤。该实验应用止血带挤压大鼠双下肢构建挤压综合动物模型，通过外源性褪黑素干预处理，一方面观察其对挤压综合征模型大鼠酸碱平衡紊乱、氧化应激损伤、横纹肌溶解及存活率等方面的影响，另一方面观察其对动物模型心肌酶、心肌氧化应激损伤、炎性细胞因子、心肌损伤病理改变等的影响。实验分为两部分，一、褪黑素对挤压综合征动物模型骨骼肌缺血再灌注损伤疗效评估。二、褪黑素对挤压综合征动物模型继发心肌损伤的保护作用。
　　方法:第一部分：将 Isamu Murata等挤压综合征造模方法加以利用改进，利用5%的戊巴比妥钠溶液以50mg/kg剂量腹腔麻醉大鼠，利用卡式止血带挤压大鼠后肢根部，止血带拉力等同于3kg重物的压力，5小时后撤除止血带恢复挤压肢体血流灌注。将wistar雄性大鼠按照保证在再灌注6小时后各组存活10只造模大鼠的原则，随机分为四组：空白组（SHAM组）、模型组（CS组）、扩容组（NS组）及褪黑素组（MEL组），检测大鼠后肢再灌注6小时血清中钾离子（K+）、肌酸激酶同工酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶(CAT)的活性及丙二醛（MDA）含量，再灌注6小时检查动脉血气，同时观察各组大鼠腓肠肌光镜下苏木精伊红（Hematoxylin eosin，HE）染色病理改变；另外将81只大鼠分为SHAM组(n=10)、CS组（n=30）、NS组（n=25）、MEL组（n=16），观察再灌注48小时各组大鼠死亡的时间点以进行生存曲线分析。第二部分：根据第一部分造模及分组方法，同样以保证在再灌注12小时后存活10只造模大鼠的原则，将雄性wistar大鼠随机分为四组：SHAM组、CS组、NS组及MEL组，检测各组大鼠后肢再灌注12小时血清肌钙蛋白I(TnI)，肌酸激酶同工酶（CK-MB）、超氧化物歧化酶、丙二醛水平，炎性细胞因子 TNF-α、IL-1β水平，观察各组大鼠心肌组织光镜下HE染色病理改变。
　　结果:再灌注6小时，CS组动脉血气提示明显的代谢性酸中毒，而MEL组酸碱平衡紊乱较CS组明显改善。与SHAM组比较，CS组血清中K+、CK、LDH的含量显著上升，GSH-Px、SOD、CAT的活性显著升高；与CS组比较，MEL组血清中CK、LDH、K+的含量显著降低，GSH-Px、SOD、CAT的活性显著下降。CS组中血清中MDA的含量较SHAM组显著升高；而MEL组血清中MDA含量较CS组显著降低。SHAM组腓肠肌纤维间未见水肿及炎症细胞浸润，肌肉纤维正常分布；CS组、NS组腓肠肌纤维间质水肿明显，肌纤维结构严重破坏，骨骼肌横纹紊乱；MEL组肌肉纤维间可见轻度水肿，纤维组织稍紊乱，其形态结构明显好于CS组与NS组。SHAM组大鼠的生存率为100%，CS组大鼠的生存率为20%，NS组大鼠的生存率29.2%，MEL组大鼠的生存率为56.3%。
　　再灌注12小时，CS组血清中TnI，CK-MB含量显著升高，褪黑素干预后的MEL组血清中TnI，CK-MB较CS组明显降低；CS组血清及心肌SOD活性较SHAM组显著降低，血清及心肌MDA、TNF-α、IL-1β水平显著升高，MEL组血清及心肌SOD活性较CS组显著升高，血清及心肌MDA、TNF-α、IL-1β水平显著降低。通过HE染色评估心肌损伤病理改变，SHAM组心肌细胞结构完整、心肌横纹清晰可见；CS组心肌坏死和炎性细胞浸润明显,心肌横纹消失；MEL组心肌组织损伤较CS有所减轻。
　　结论:利用卡式止血带能成功建立挤压综合征动物模型，在下肢恢复血流灌注前利用褪黑素早期干预，对挤压综合征模型骨骼肌缺血再灌注损伤具有保护作用；褪黑素能有效的抑制缺血再灌注过程中氧化应激损伤，减轻横纹肌溶解；并能提高挤压综合征模型大鼠生存率，改善缺血再灌注腓肠肌损伤。同时挤压综合征模型能引起心肌损伤，褪黑素通过其对心肌酶、内源性抗氧化酶活性、炎性细胞因子、心肌组织的改变发挥对心肌组织的保护作用，减轻挤压综合征模型的心肌损伤。

目录

声明

英文缩略词对照表

前言

第一部分：褪黑素对挤压综合征动物模型骨骼肌缺血再灌注损伤的疗效评估

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

第二部分：褪黑素对挤压综合征动物模型心肌损伤的保护作用

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

附录

个人简历

在校期间研究成果

致谢

综述：褪黑素对缺血再灌注损伤的保护作用及其临床应用前景