IL-17在双酚A暴露诱导小鼠脂肪组织炎症中作用的研究

摘要

研究背景：双酚A（Bisphenol A，BPA）作为一种重要工业原料，在世界范围内被广泛生产与使用。BPA主要被用来当做塑料制品添加剂，并广泛存在于罐装食品，奶瓶，水瓶，密封胶，眼镜等日常用品中。在加热或者遇到酸时，BPA会从塑料等制品中释放出来，导致人类的广泛暴露。BPA是一种典型的环境内分泌干扰物，具有较弱的雌激素效应。近年来，流行学研究和动物实验研究均报道BPA暴露与肥胖密切相关。新兴的代谢性炎症研究表明，肥胖属于一种全身慢性低度炎症状态，这种状态主要与脂肪组织炎症状态有关，而脂肪组织炎症又是肥胖相关疾病的重要驱动因素。IL-17是辅助性T细胞Th17细胞分泌的主要炎性因子，在炎症及免疫相关疾病的发生发展中发挥关键作用，已成为近年来炎症性疾病讨论和研究的热点。目前有关IL-17在BPA诱导肥胖中对脂肪组织炎症影响及调控作用仍然不清楚。
　　研究目的：通过动物实验探讨环境相当剂量的 BPA暴露对小鼠脂肪组织炎性细胞浸润、炎症细胞因子表达、IL-17表达和Th17细胞比例的影响，并用IL-17抗体下调IL-17，探讨IL-17对BPA暴露诱导小鼠脂肪组织炎症的调控作用。为制定环境BPA暴露健康危害的防治措施和策略提供实验资料依据。
　　研究方法：
　　第一部分：BPA暴露诱导小鼠脂肪组织炎症中IL-17表达的研究
　　4周龄C57BL/6J野生型雄性小鼠随机分为溶剂对照组、10nM BPA组、100nM BPA组和1000nM BPA组，每组48只小鼠。每组分别用普通饮食（ND）和高脂饮食（HFD）各喂养24只。小鼠通过饮水摄入BPA，分别于暴露8周、12周、16周和20周时处死6只动物，取附睾脂肪垫进行后续实验。
　　第二部分：IL-17抗体对BPA诱导的小鼠脂肪组织炎症的影响
　　4周龄C57BL/6J野生型雄性小鼠随机分为非BPA暴露组和BPA暴露组，BPA暴露组小鼠通过饮水摄入1000nM BPA，所有小鼠均用HFD喂养，每组中再分别设立溶剂对照组、IgG同型对照组和IL-17抗体处理组，每组16只小鼠。IgG同型对照组和IL-17抗体处理组每周分别腹腔注射100μg IgG和100μg IL-17抗体一次。分别于处理8周和16周后处死小鼠，取附睾脂肪垫进行后续实验。
　　用组织病理学观察附睾脂肪组织炎性细胞浸润情况，用免疫组化和酶联免疫吸附试验检测脂肪组织炎性因子 IL-17、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达和含量，用RT-PCR检测IL-17 mRNA水平，用流式细胞术分析SVF中Th17细胞比例。
　　结果：
　　1. BPA暴露对小鼠体重的影响
　　与溶剂对照组相比，BPA暴露组ND喂养和HFD喂养小鼠体重均呈现时间和剂量依赖性增加。在ND喂养小鼠中，与溶剂对照组相比，小鼠体重增加在100nM BPA暴露组和1000nM BPA暴露组，分别从19周和12周开始，差异具有统计学意义（P<0.05）；在HFD喂养小鼠中，与溶剂对照组相比，小鼠体重增加在100nM BPA暴露组和1000nM BPA暴露组，分别从15周和11周开始，差异具有统计学意义（P<0.05）。与ND喂养相比，BPA对HFD喂养小鼠体重增加的影响更明显。
　　2. BPA暴露对小鼠脂肪组织炎症的影响
　　2.1脂肪组织炎症的组织病理学观察结果
　　与ND喂养小鼠相比，HFD喂养小鼠脂肪组织脂肪细胞变大，炎性浸润增多；与各自溶剂对照组相比，ND和HFD喂养小鼠中，脂肪组织脂肪细胞变大和炎性浸润增多均呈时间和BPA暴露剂量依赖性，在HFD喂养小鼠中更明显。
　　2.2脂肪组织细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6免疫组织化学检测结果
　　与ND喂养小鼠相比，HFD喂养小鼠脂肪组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达明显增强，与溶剂对照组相比，BPA暴露组小鼠脂肪组织中 TNF-α、IL-1β和 IL-6表达都呈现时间和剂量依赖性增强，在HFD喂养小鼠中更明显。
　　2.3脂肪组织细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量ELISA检测结果
　　与ND喂养小鼠相比，HFD喂养小鼠脂肪组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高；与溶剂对照组相比，BPA暴露组小鼠脂肪组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量呈现时间和剂量依赖性升高。在ND喂养小鼠中，与溶剂对照组相比较，TNF-α和IL-6含量升高在100nM BPA组和1000nM BPA组从12周开始，在10nM BPA组从16周开始，差异具有统计学意义（P<0.05）；IL-1β含量升高在1000nM BPA组从12周开始，在100nM BPA组从16周开始，在10nM BPA组从20周开始，差异具有统计学意义（P<0.05）。在HFD喂养小鼠中，与溶剂对照组相比较，TNF-α含量升高在1000nM BPA组从8周开始，在100nM BPA组和10nM BPA组从12周开始，差异具有统计学意义（P<0.05）；IL-6含量升高在1000nM BPA组和100nM BPA组从8周开始，在10nM BPA组从12周开始，差异具有统计学意义（P<0.05）；IL-1β含量升高在1000nM BPA组从8周开始，在100nM BPA组从12周开始，在10nM BPA组从16周开始，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　3. BPA暴露对小鼠脂肪组织IL-17的影响
　　3.1脂肪组织IL-17表达IHC检测结果
　　与ND小鼠相比，HFD喂养小鼠脂肪组织 IL-17表达明显增加，与溶剂对照组相比，BPA暴露组脂肪组织IL-17表达呈时间和剂量依赖性增加，在HFD喂养小鼠中更明显。
　　3.2脂肪组织IL-17 mRNA表达RT-PCR检测结果
　　与ND喂养小鼠相比，HFD喂养小鼠脂肪组织IL-17 mRNA的表达上调；与溶剂对照组相比，BPA暴露组脂肪组织IL-17 mRNA表达呈时间和剂量依赖性上调。在ND喂养小鼠中，与溶剂对照组相比，IL-17 mRNA表达上调在1000nM BPA和100nM BPA组从12周开始，在10nM BPA组从20周时，差异具有统计学意义（P<0.05）；在HFD喂养小鼠中，与溶剂对照组相比较，IL-17mRNA表达在1000nM BPA组和100nM BPA组从12周开始，10nM BPA组从16周开始，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　3.3脂肪组织IL-17含量ELISA检测结果
　　与ND喂养小鼠相比，HFD喂养小鼠脂肪组织 IL-17含量升高；与溶剂对照组相比，BPA暴露组脂肪组织IL-17含量呈时间和剂量依赖性升高。在ND喂养小鼠中，与溶剂对照组相比较，IL-17含量升高在1000nM BPA组和100nM BPA组从16周开始，在10nM BPA组从20周时，差异具有统计学意义（P<0.05）；在HFD喂养小鼠中，与溶剂对照组相比较，IL-17含量升高在1000nM BPA组和100nM BPA组从12周开始，在10nM BPA组从16周开始，差异具有统计学意义（P<0.05）。4. BPA暴露对小鼠附睾脂肪组织中Th17细胞比例的影响
　　与ND喂养小鼠相比，HFD喂养小鼠脂肪组织中Th17细胞比例升高；与溶剂对照组相比，BPA暴露组脂肪组织Th17细胞比例呈现时间和剂量依赖性升高。在ND喂养小鼠中，与溶剂对照组相比较，Th17细胞比例升高在1000nM BPA组从12周开始，在100nM BPA组从16周开始，在10nM BPA组从20周时，差异具有统计学意义（P<0.05）；在HFD喂养小鼠中，与溶剂对照组相比较，Th17细胞比例升高在1000nM BPA组和100nM BPA组从12周开始，在10nM BPA组从20周时，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　5. IL-17抗体对BPA暴露诱导的小鼠脂肪组织IL-17表达的影响
　　IL-17表达在1000nM BPA暴露组中要比非BPA暴露组中高，在非BPA暴露组和1000nM BPA暴露组中，IgG处理对IL-17表达没有明显影响；与各自IgG同型对照相比，IL-17抗体处理HFD喂养小鼠，脂肪组织IL-17表达在非BPA暴露组内，以及1000nM BPA暴露组内均明显减少，而且1000nM BPA暴露组减少较非BPA暴露组更明显，表明IL-17抗体可以有效降低BPA暴露诱导的脂肪组织中IL-17水平。
　　6. IL-17抗体对BPA暴露小鼠脂肪组织Th17细胞比例的影响
　　Th17比例在1000nM BPA暴露组中要比非BPA暴露组中高，在非BPA暴露组和1000nM BPA暴露组中，IgG处理对Th17比例没有明显影响；与各自IgG同型对照相比，IL-17抗体处理使得Th17比例有下调趋势，但是没有统计学意义（P>0.05）。
　　7. IL-17抗体对BPA暴露诱导的小鼠体重增加的抑制作用
　　1000nM BPA暴露组小鼠体重和附睾脂肪垫系数高于非BPA暴露组；在非BPA暴露组和1000nM BPA暴露组中，与各自的溶剂对照组相比较，IgG处理对小鼠体重和附睾脂肪垫系数影响不明显；与各自IgG同型对照相比，IL-17抗体处理使小鼠体重有下降的趋势，但是不具有统计学意义（P>0.05）；与各自IgG同型对照相比，IL-17抗体处理使小鼠附睾脂肪垫系数有下降的趋势，但是在非BPA暴露组中不具有统计学意义（P>0.05），在1000 nM BPA暴露组中具有统计学意义（P<0.05）。
　　8. IL-17抗体对BPA暴露诱导的小鼠脂肪组织炎症的改善作用
　　8.1脂肪组织病理学结果
　　1000nM BPA暴露组炎性浸润要比非BPA暴露组严重；在非BPA暴露组中和1000nM BPA暴露组中，与各自的溶剂对照组相比较，IgG处理对炎性浸润影响不明显；与各自IgG同型对照相比，IL-17抗体处理使炎性浸润减轻。
　　8.2小鼠脂肪组织TNF-α、IL-1β和IL-6的组化结果
　　TNF-α、IL-1β和IL-6的表达在1000nM BPA暴露组中的表达要比非BPA暴露组中的表达高，在非BPA暴露组中和1000nM BPA暴露组中，与各自的溶剂对照组相比较，IgG处理对TNF-α、IL-1β和IL-6的表达影响不明显；与各自IgG同型对照相比，IL-17抗体处理使得TNF-α、IL-1β和IL-6的表达明显下调。
　　结论：
　　1、低剂量BPA暴露可以促进小鼠脂肪组织炎性细胞浸润和炎性因子表达增加。
　　2、低剂量BPA暴露可以诱导小鼠脂肪组织IL-17表达上调和Th17细胞比例增加。
　　3、IL-17抗体可以降低BPA暴露引起的小鼠脂肪组织中IL-17水平，但对Th17细胞数量没有显著作用；
　　4、IL-17抗体可以改善BPA暴露引起的小鼠体重增加、脂肪组织炎性细胞浸润和炎性因子分泌。

目录

声明

缩略词表

1 引言

2 材料与方法

2.1 仪器和试剂

2.2 实验动物和处理

2.3 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测附睾脂肪组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量

2.4流式细胞术（FCM）检测附睾脂肪组织基质血管碎片（stromal vascular fraction, SVF）中Th17细胞比例

2.5 免疫组化（IHC）检测附睾脂肪组织IL-17、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达

2.6 RT-PCR检测附睾脂肪组织IL-17表达

2.7 统计分析方法

2.8 实验流程图

3结果

3.1 BPA暴露对小鼠体重增长的影响

3.2 BPA暴露诱导小鼠脂肪组织炎症

3.3 BPA暴露对小鼠脂肪组织IL-17表达的影响

3.4 BPA 暴露对小鼠附睾脂肪垫组织中Th17细胞比例的影响

3.5 IL-17抗体处理对小鼠附睾脂肪组织IL-17表达的影响

3.6 IL-17抗体处理对小鼠附睾脂肪组织Th17细胞比例的影响

3.7 IL-17抗体处理对BPA暴露诱导的小鼠肥胖的抑制作用

3.8 IL-17抗体处理改善BPA暴露诱导的小鼠脂肪组织炎症

4讨论

5结论

参考文献

个 人 简 历

致谢

综述:以IL-17为靶治疗自身免疫性疾病和炎性疾病的进展