ET-1、VEGF在胰蛋白酶导致的急性肺损伤中的表达及意义

摘要

目的：通过持续尾静脉泵入胰蛋白酶(Trypsin, TPS)模拟重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis, SAP)时胰酶释放入血来制作急性肺损伤模型，观察内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)、血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)在肺组织中的表达变化情况并检测肺组织毛细血管通透性，探讨ET-1、VEGF在胰蛋白酶导致的急性肺损伤中的作用机制及意义。
　　方法：随机选取72只体重为230-250g的健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)级大鼠，随机分成3组，即模型组(胰蛋白酶注射组，即TPS组)、药物抑制组(胰蛋白酶+乌司他丁(Ulinastatin,UTI)注射组，即UTI组)、正常对照组(生理盐水注射组，即CON组)，每组24只，随机将每组再按时间点分为4个时间亚组，每个时间亚组6只大鼠，分别为3h组、6h组、12h组、24h组。TPS组将胰蛋白酶以15000U/Kg/h速度持续泵入大鼠尾静脉制作急性肺损伤模型；CON组将等量生理盐水采用同样方法泵入大鼠尾静脉作对照；UTI组同TPS组，制模后立即乌司他丁5万单位皮下注射。观察三组大鼠静脉注射后的一般情况，处死动物前30min立即从股静脉注入2%伊文思蓝(Evans Blue, EB)(0.8 ml/kg)，分别于造模成功后3h、6h、12h、24h各时间点眼底静脉采血后处死大鼠采集标本。采取眼底静脉血1.5ml，采用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immuneosorbent assay, ELISA)检测血浆中ET-1、VEGF的变化；于各时间点采集固定部位大小约1cm3肺组织，置入4ml甲酰胺溶液中，测量EB含量与肺组织干重比评价肺毛细血管通透性；取一定量肺组织，测量湿重及干重，计算肺组织湿干重比(Wet/dry weight ratio, W/D)；取一定量肺组织分别用4%多聚甲醛、3%戊二醛固定，于光镜及透射电镜下观察组织的病理形态学情况；通过ELISA法检测肺组织中ET-1、VEGF蛋白的表达变化，实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System, QPCR)检测肺组织中ET-1 mRNA和VEGF mRNA的表达变化。
　　结果：
　　1. TPS组、CON组及UTI组大鼠存活率均为100%。TPS组各时间点W/D值较CON组及UTI组明显增大(P＜0.05)，且TPS组随时间延长，W/D值逐渐增大。各时间点 CON组大鼠肺组织大体及镜下病理基本正常，UTI组各时间点组均有不同程度损伤，与TPS组同一时间相比病变较轻。TPS组肺损伤较其余两组明显加重：大体病理如下：肺组织3h开始即出现点片状暗红色出血，局部水肿，有少量非血性渗出，随时间延长病变呈明显加重趋势，有的发展成“大叶性肺炎”，伴有血性渗出；光镜下病理：肺泡大小、分布紊乱，肺间质明显增宽，毛细血管扩张、淤血，肺间质充血、水肿及肺泡腔内出现渗出增多，支气管和肺泡周围大量的炎性细胞浸润，随时间延长肺损伤程度逐渐加重；电镜下病理：肺组织毛细血管及肺泡上皮细胞3h开始即有损伤，细胞器变性，基底膜水肿、变性，随时间延长毛细血管及肺泡上皮细胞损伤逐渐加重，基底膜变性加重，局部断裂，毛细血管管腔狭窄，腔内血液瘀滞，细胞膜破裂，线粒体、内质网等细胞器重度变性，细胞核固缩、溶解。
　　2.通过ELISA方法检测血浆ET-1和VEGF蛋白发现，CON组各时间点无显著差异，与CON组比较，TPS组表达显著增高，3h开始即升高，12h时达高峰(P＜0.01)，UTI组较TPS组ET-1和VEGF蛋白的表达水平下降(P＜0.01)。
　　3.通过ELISA方法检测肺组织ET-1和VEGF蛋白发现，CON组各时间点无显著差异，与CON组比较，TPS组表达显著增高，3h开始即升高，12h时达高峰(P＜0.01)，UTI组较TPS组ET-1和VEGF蛋白的表达水平下降(P＜0.01)。
　　4.通过QPCR检测肺组织ET-1 mRNA和VEGF mRNA发现，与CON组比较，TPS组表达水平自3h开始明显升高，12h时达高峰(P＜0.01)，UTI组较TPS组ET-1 mRNA和VEGF mRNA的表达水平降低(P＜0.01)。
　　5.通过伊文思蓝漏出率法评价肺毛细血管通透性发现，CON组各时间点无显著差异，与CON组比较，TPS组肺组织毛细血管通透性显著增加(P＜0.01)，UTI组较TPS组毛细血管通透性下降(12h组、24h组P＜0.01)。
　　结论：
　　1．胰蛋白酶可造成急性肺损伤，是重症急性胰腺炎时胰腺外器官损伤的重要原因之一。
　　2．胰蛋白酶导致的急性肺损伤早期肺组织ET-1和VEGF因子高表达，致血管收缩、通透性增加，导致毛细血管内皮屏障破坏，可能是胰蛋白酶导致微循环障碍的主要机制之一。血浆ET-1和VEGF因子的表达趋势与肺组织相似，但数值高于肺组织，说明除了肺组织之外还有其他组织器官ET-1和VEGF因子高表达。
　　3．乌司他丁对SAP时急性肺损伤及微循环障碍有一定的保护作用。

目录

声明

中英文缩略词对照表

1 引言

2 资料及方法

2.1 对象

2.2 方法

3 统计学分析

4 结果

4.1 三组大鼠静脉注射后的一般情况

4.2 三组大鼠静脉注射后肺组织湿干重比的变化情况

4.3 三组大鼠静脉注射后肺组织病理学的变化情况

4.4 三组大鼠静脉注射后血浆中ET-1、VEGF 表达ELISA分析结果

4.5 三组大鼠静脉注射后肺组织中ET-1、VEGF表达ELISA分析结果

4.6 三组大鼠静脉注射后肺组织ET-1mRNA和VEGFmRNA QPCR分析结果

4.7 三组大鼠肺组织EB含量与干重比(μg/g)结果

4.8附图、表

5 讨论

5.1 胰蛋白酶所致ALI动物模型的建立

5.2肺血管内皮系统的损害与胰腺炎相关肺损伤

5.3 ET-1与胰蛋白酶所致急性肺损伤

5.4 VEGF与胰蛋白酶致急性肺损伤

5.5 乌司他丁的保护作用

6 结论

参考文献

附录

致谢

综述:重症急性胰腺炎常见并发症的研究进展