TRPC1在血管平滑肌中收缩和乳腺癌细胞凋亡中的作用研究

摘要

第一部分TRPC1在胸主动脉平滑肌细胞收缩中的作用研究
　　背景：
　　TRPC通道是瞬时受体电位中第一类被发现的通道，该通道和果蝇的 TRP通道的同源性最高，因此又被称为传统型 TRP通道。TRPC亚家族不同成员其分布不同，其被激活后发挥的功能也不同。TRPC通道参与转录因子的激活、心肌肥厚以及血小板激活等多种生理病理过程。TRPC1是最早被克隆哺乳类瞬时受体电位通道之一，其分布广泛，在脑、心脏、肾脏、肺、骨骼肌、睾丸、卵巢、唾液腺都有较高水平的表达。目前研究证明：TRPC1不仅参与受体介导，而且在钙依赖的分泌和收缩过程也有重要作用。而胸主动脉平滑肌组织中TRPC1、TRPC4、TRPC5和BKCa蛋白相互作用强度的变化以及TRPC1、TRPC4和TRPC5在胸主动脉平滑肌收缩中的作用目前仍不清楚。
　　目的：
　　研究胸主动脉平滑肌组织 TRPC1、TRPC4、TRPC5和BKCa蛋白相互作用强度的变化，另外，本实验同时研究了TRPC1、TRPC4和TRPC5在胸主动脉平滑肌收缩中的作用。
　　方法：
　　1、瞬时转染siRNA
　　将特异性 TRPC1 siRNA转染到胸主动脉，24 h后将胸主动脉进行后续实验。
　　2、离体胸主动脉制备以及张力测定
　　离体胸主动脉迅速放进 Krebs溶液中等距分为等长血管（长度约2 mm），两端固定在微血管张力测定仪器中，用分析软件数据采集和分析胸主动脉收缩能力。
　　3、免疫共沉淀
　　使用 TRPC1、TRPC4和 TRPC5抗体分别相互共沉淀，检测胸主动脉平滑肌组织TRPC1、TRPC4、TRPC5和BKCa蛋白相互作用强度的变化。
　　结果：
　　1、在胸主动脉张力实验中，TRPC1 siRNA处理后的胸主动脉平滑肌中TRPC1蛋白表达明显降低，而且，内皮素1引起的收缩较对照组显著增强。
　　2、在胸主动脉张力实验中，TRPC4 siRNA处理后的胸主动脉平滑肌中TRPC4蛋白表达明显降低，而且，内皮素1引起的收缩较对照组显著减弱。
　　3、在胸主动脉张力实验中，TRPC5 siRNA处理后的胸主动脉平滑肌中TRPC5蛋白表达明显降低，而且，内皮素1引起的收缩较对照组显著增强。
　　4、在免疫共沉淀中，TRPC1可以共沉淀TRPC4、TRPC5和BKCa，TRPC4可以共沉淀TRPC1，TRPC5可以共沉淀TRPC1、BKCa，但TRPC4不能共沉淀TRPC5。
　　结论:
　　TRPC1分别和TRPC4、TRPC5形成异聚体通道，并且TRPC1、TRPC5和BKCa形成钙信号复合物调节血管平滑肌收缩。
　　第二部分TRPC1在乳腺癌细胞凋亡中的作用研究
　　背景：
　　乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其严重影响妇女身心健康，甚至危及患者生命，在欧美国家，乳腺癌的发病率高居女性恶性肿瘤首位，虽然我国属低发地区，但是其发病率呈现逐年上升趋势。乳腺癌主要是由于乳腺导管上皮发生恶性改变而产生，表现为乳腺肿痛、有肿块等。目前，乳腺癌的治疗包括五大块：分别是手术治疗、化疗、内分泌治疗、放疗和分子靶向治疗。分子生物学的发展和对发病机制从细胞、分子水平的深入认识，使得肿瘤治疗进入了一个新的分子靶向治疗的时代。与化疗、放疗相比，分子靶向治疗高效、选择性地杀伤肿瘤细胞，使得治疗更有针对性且副作用小。
　　目前，靶向递送 siRNA到特定的细胞在药物研发领域有很大的潜力，siRNA不仅可以作为一个研究工具来抑制靶基因的表达，同时也可作为一种治疗方法治疗各种疾病。为了靶向递送siRNA，我们设计了一种靶向肽，该小肽可以包裹siRNA并形成纳米粒子来递送siRNA到乳腺癌细胞，这种靶向性纳米粒子不仅能够通过乳腺癌细胞表面受体靶向递送siRNA并且对正常细胞损坏很小，这一特性大大提高了这项技术的实用性。
　　目的：
　　本研究中，我们利用课题组合成的多肽1包裹siRNA形成超分子纳米粒子，从而实现特异性地递送TRPC1 siRNA到乳腺癌细胞中。此外，我们用此靶向肽递送TRPC1 siRNA也能够引起乳腺癌细胞的凋亡。
　　方法：
　　1乳腺癌细胞培养
　　乳腺癌细胞MDA-MB-231采用DMEM培养基培养，培养基中添加有10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素、100 g/mL链霉素，在37摄氏度，5% CO2培养箱中培养。
　　2多肽1/siRNA结合能力测试
　　用不同浓度比的多肽1与siRNA进行凝胶阻滞分析测试。并且用肝素（去聚阴离子复合物稳定剂）作用于该复合物，观察结果。
　　3多肽1/siRNA复合物稳定性试验
　　检测多肽1/siRNA复合物在RNA核酸酶和小鼠血清孵育环境下的稳定性，同时用肝素释放siRNA后用凝胶阻滞分析测试siRNA的稳定性。
　　4乳腺癌细胞凋亡实验研究
　　通过Western blot检测用多肽1/siRNA复合物转染后凋亡标签蛋白Bax的表达变化，并与对照组进行比较，观察多肽1/siRNA复合物的优劣势。
　　5乳腺癌细胞特异性基因体外沉默实验
　　通过Western blot检测用多肽1/siRNA复合物转染后TRPC1的表达变化，并与对照组进行比较，观察多肽1/siRNA复合物的优劣势。
　　6统计学处理
　　所有实验数据均以平均值±标准误表示并运用Sigma Plot12.5软件进行非配对t检验，P<0.05时认为两组之间的差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1、当多肽1与siRNA比例大于100:1时，多肽1和siRNA结合能力逐渐增强。
　　2、在含有核酸酶的溶液中多肽1/siRNA复合物较裸露siRNA的稳定性明显提高。
　　3、在小鼠血清中多肽1/siRNA复合物较裸露siRNA的稳定性明显提高。
　　4、多肽1/TRPC1 siRNA复合物导入乳腺癌细胞有促凋亡的效应。
　　5、多肽1/TRPC1 siRNA复合物导入乳腺癌细胞有抑制TRPC1表达的作用。
　　结论：
　　本实验验证了我们课题组新合成的多肽1导入 TRPC1 siRNA的可行性，为siRNA治疗乳腺癌提供潜在新的理论依据和方法。

目录

声明

中英文缩略词对照表

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验溶液配制

2.3 实验方法

3 结果

3.1 TRPC1在内皮素1引起的胸主动脉收缩中的作用

3.2 TRPC4在内皮素1引起的胸主动脉收缩中的作用

3.3 TRPC5在内皮素1引起的胸主动脉收缩中的作用

3.4 TRPC1、TRPC4、TRPC5和BKCa蛋白相互作用

4 讨论

5 结论

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学分析处理

3 结果

3.1 利用琼脂糖凝胶电泳检测多肽1/TRPC1 siRNA结合能力

3.2 多肽1/TRPC1 siRNA复合物在核糖核苷酸酶中稳定性

3.3 多肽1/TRPC1 siRNA纳米粒子在血清中的稳定性试验

3.4 多肽1/TRPC1 siRNA复合物导入乳腺癌细胞后TRPC1蛋白表达情况

3.5 多肽1/TRPC1 siRNA复合物导入乳腺癌细胞后凋亡实验

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述:TRPC-BKCa信号复合物在钙库操纵钙内流分子组成中的作用及其机制