利用微小基因组建立评价HCV NS5B聚合酶活性的细胞系统

摘要

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)属于黄病毒科(Flaviviridae),肝炎病毒属(Hepacivirus),是引起慢性肝病的主要病原体之一。HCV感染呈全球流行状态,是导致肝硬化和肝癌的最主要病因,约有1.3亿HCV感染者。HCV为单正链RNA病毒,基因组全长约为9.6 kb,两端含有5′非编码区(5′UTR)和3′非编码区(3′UTR),中间为一个开放阅读框(ORF)。开放阅读框可编码一个多聚蛋白前体,然后在宿主与病毒蛋白酶的共同作用下加工成为3个结构蛋白和7个非结构蛋白。结构蛋白分别为核心蛋白(Core)、包膜糖蛋白E1和E2,非结构蛋白分别为p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中,非结构蛋白NS5B具有RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)活性,是HCV RNA合成和复制的关键酶,是抗 HCV治疗的关键靶点。随着对病毒基因组复制机制的深入理解,利用RNA病毒的反向遗传技术建立的微小基因组系统为研究 HCV的复制、与宿主细胞之间的相互作用、致病机制以及抑制剂的筛选提供了新的工具,进一步为建立HCV NS5B抑制剂的高通量筛选体系提供了技术支撑。因此,本研究利用HCV NS5B的RdRp活性和反向遗传技术,建立可评价HCV NS5B聚合酶活性的新型细胞系统,为HCV NS5B抑制剂的高通量筛选提供新的实验系统。　　基于目前国内外学者对于HCV复制机理的最新进展,并且以本室前期的研究为基础,首先分别设计并且构建了真核表达质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP、微小基因组(-)5UIRrG(-)3U和真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U。然后通过将pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pCMV/5UrFI3Urz质粒共转染BHK-21细胞,检测细胞中萤火虫荧光素酶(FLuc)活性,对pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP中NS5B活性进行了验证。通过将pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U和pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP质粒共转染BHK-21细胞,检测细胞培养上清及细胞中的Gaussia荧光素酶(GLuc)活性,对微小基因组(-)5UIRrG(-)3U的功能进行了鉴定。主要研究结果如下:　　1.成功构建了表达HCV NS3-5B复制复合体的质粒并鉴定了NS5B聚合酶的活性　　(1)通过PCR方法扩增HCV NS3-5B全长基因片段,然后成功构建了真核表达质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP。酶切鉴定以及测序比对正确后,转染至BHK-21细胞,荧光成像可以观察到绿色荧光蛋白的表达,Western Blot检测结果显示NS3-4A蛋白和NS5B蛋白均在细胞中得到表达。　　(2)重组质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pCMV/5UrFI3Urz(本室前期构建)共转染至BHK-21细胞中,结果显示所构建的真核表达质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP中的NS5B具有RdRp活性,并且NS3-5B复制复合体中的NS5B活性明显高于单独的NS5B活性。　　2.成功构建了(-)5UIRrG(-)3U微小基因组并鉴定了其功能　　(1)设计了一段两端含有HCV负链5′UTR和负链3′UTR序列,中间含有EMCV IRES-DsRed2正向序列和GLuc编码基因的反向互补序列(rvGLuc)的微小基因组片段(-)5UIRrG(-)3U。分别设计扩增各基因片段的上下游引物,然后利用重叠延伸PCR技术将扩增出的各基因片段成功拼接。琼脂糖凝胶电泳结果显示各基因片段大小正确。　　(2)成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U。酶切鉴定以及测序比对正确后,转染至 BHK-21细胞后,红色荧光蛋白得到表达,细胞内重组质粒中的微小基因组具有正常的功能。　　3.初步建立了评价HCV NS5B聚合酶活性的细胞系统　　在pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U重组质粒共转染的BHK-21细胞中,荧光成像可以观察到绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白同时得到表达,并且位于复制复合体中的NS5B蛋白可以使微小基因组片段进行正常的复制和转录,GLuc得到表达并且分泌至细胞培养液中,进而可以通过检测 GLuc的活性来评价NS5B聚合酶的活性。　　综上所述,本研究成功构建了HCV NS3-5B的真核表达载体和含有报告基因的微小基因组载体,将两者组合初步建立了评价HCV NS5B聚合酶活性的细胞系统。此系统为建立 NS5B抑制剂的高通量筛选系统提供了新的途径,并且进一步为利用该系统建立可用于 HCV NS5B抑制剂筛选和评价的转基因动物模型提供了实验依据。

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文献回顾

第一部分表达NS3-5B蛋白的真核表达质粒构建及NS5B聚合酶活性鉴定

1. 实验材料与仪器

1.1 质粒、菌株及细胞株

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 实验方法

2.1 引物设计及合成

2.2 重组质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP的构建及鉴定

2.3细胞培养

2.4 细胞转染及荧光成像观察

2.5 Western Blot检测

2.6 细胞转染及萤火虫荧光素酶（FLuc）活性检测

2.7 统计学分析

3 实验结果

3.1重组质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP酶切鉴定及序列分析结果

3.2 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP转染细胞后荧光成像结果

3.3 HCV非结构蛋白NS3-4A和NS5B Western Blot检测结果

3.4 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pCMV/5UrFI3URz共转染细胞后FLuc活性测定结果

4 讨论

1 实验材料与仪器

1.1 质粒、菌株及细胞株

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 实验方法

2.1 引物的设计及合成

2.2. 微小基因组片段(-)5UIRrG(-)3U的拼接

2.3 重组质粒pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U的构建及鉴定

2.4 细胞培养

2.5 细胞转染及荧光成像观察

2.6 细胞转染及Gaussia荧光素酶（GLuc）活性检测

2.7 统计学分析

3 实验结果

3.1 微小基因组(-)5UIRrG(-)3U构建示意图

3.2 微小基因组(-)5UIRrG(-)3U各片段PCR扩增结果

3.3重组质粒pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U酶切鉴定及序列分析结果

3.4 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U转染细胞后荧光成像结果

3.5 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U共转染细胞后荧光成像结果

3.6 pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U共转染细胞后GLuc活性测定结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢