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2.1.1细胞株
2.1.3主要试剂和耗材
2.1.4 主要实验试剂的配制
2.1.4.1常用细胞培养试剂的配制
2.1.5 主要仪器设备
2.2.1 细胞培养
2.2.2细胞总蛋白的提取：
（1）取处于对数生长期的细胞，培养板放置在冰上，吸净培养基，用4℃预冷的PBS清洗两次；
（2）加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液，用细胞刮刮净皿内细胞，将悬液吸入EP管中，标明
（3）上述EP管始终保持放在冰上，将EP管置于涡旋振荡器上5min震荡一次，一共6次，以使细胞充分裂
（4）裂解完成后，将装有蛋白的EP管放入4℃离心机中，12000g，离心10min；
（5）取出EP管，蛋白质即存在上清液当中，小心吸取移至新的EP管中，在管上标注蛋白名称及提取日期；
（6）蛋白定量后，将蛋白样品与5×loading buffer按体积比1:4混合；
（7）将EP管封紧盖口，插入海绵垫水浴锅沸水中煮10min；
（8）煮好后置于冰上冷却1min后放入-20℃冰箱保存备用。
2.2.3蛋白质免疫印迹
2.2.3.1 SDS-PAGE电泳及电转：
（1）配胶：将配套的1.5mm玻璃板安装在配胶的架子上，对照实验说明书，在小烧杯内配制相应浓度的分离
（2）上样：将胶安装在架子上置入电泳盒内，加入实现配制好的1×电泳液于电泳槽中，慢慢垂直向上拔出梳子
（3）电泳：连接电源，上层的浓缩胶用80V的电压跑，大约30min后，查看胶中蛋白marker条带是
（4）电转：在电泳快要结束时即可准备合适大小的PVDF膜和滤纸。PVDF膜用甲醇激活，翘玻板撬开玻璃
2.2.3.2封闭及孵育抗体
取出过夜孵育一抗的条带，加入封闭液室温封闭1h。封闭结束后，参照标记条带剪裁目标条带并做好名
2.2.3.3底物ECL发光检测：
参照说明书的方法，在避光环境下配制显影液，条带放在显影板上，加上均匀适量的显影液后即可显影拍
2.2.4 MTT实验：
（1）取对数生长期的细胞常规消化离心，1ml培养基重悬细胞沉淀，混匀并取20μl悬液进行细胞计数，根
（2）取200μl上述细胞悬液加入96孔板中，每组设置5个副孔，每块板在实验孔的左上角设置一个只加培
（3）种板后，将细胞放入细胞培养箱中培养。
（4）待细胞贴壁后，即种板2h后，记为MTT实验0h时间点。取出0h的96孔板，在避光条件下每孔加入
（5）4h后吸净板内溶液，避光条件下每孔加入150μl的DMSO溶液，并在摇床上慢摇15min。
（6）待其反应完全，将96孔板放入酶标仪中检测490nm处的吸光度值并记录。（7）24h，48h，7
细胞周期检测：
2.2.5.1收集及固定细胞
（1）当实验细胞处于对数生长期时，吸除旧的培养液，加入1mlPBS清洗。
（2）加入1ml胰酶消化细胞至部分细胞形态变圆后加入培养液终止消化，收集细胞悬液至离心管中并以900
（3）离心后弃去管中上清液，用2ml 预冷的PBS重悬管内细胞，可轻轻吹打洗涤细胞，再次离心。
（4）再次弃去管内上清液，加入70%酒精充分吹打细胞，以更好得固定细胞。再将离心管置于4℃过夜固定，
2.2.5.2染色
（1）将固定好的细胞低温1000g离心5min。
（2）小心吸出上清液后再加入2ml 4℃预冷的PBS，稍加吹打后再次离心5min，小心吸出上清液。
（3）重复②步骤。
（4）配制PI染色液：避光条件下，按照说明书在离心管中按比例加入相应试剂，具体方案如下表所示：
（5）按照说明每管加入一定量的染色液，充分吹打细胞后移至流式管中，待检测。
2.2.5.3.检测
染色完成后即可在流式细胞仪上进行样品的检测，细胞DNA含量分析用Modfit软件进行。
2.2.6 平板克隆：
（1）常规消化离心计数细胞，用DMEM培养基将其稀释至1000cells/ml
（2）预先在6孔板中加入2ml完全培养基，每孔再加入约100个实验细胞（即10μl细胞悬液/孔），每
（3）种板结束后将6孔板板放入细胞培养箱中培养。
（4）两星期后，板内长出肉眼可见细胞克隆集落，用PBS清洗2次晾干，加入含甲醛的0.1%结晶紫染液染
（5）吸净染色液，用PBS洗净6孔板后晾干
（6）计数克隆形成数量及拍照。
2.2.7软琼脂实验：
（1）预先将水浴锅调制75℃，将配制好的1.3%和0.75%低熔点琼脂糖放入水浴锅内，使其完全融化。
（2）制备下层胶：将1.3%的琼脂糖拿出，用酒精棉球擦净，取5ml琼脂糖和2×DMEM混合于15ml
（3）每孔加入1.5ml混合液并轻轻摇匀，平铺于板底且不产生气泡，再放置其于一边待凝。
（4）准备细胞:将对数生长期的细胞常规消化离心，并计数，根据计数结果，用完全培养基稀释细胞浓度至1×
（5）制备上层胶：取出0.75%琼脂糖，酒精棉球擦净，取2.4ml于15ml离心管中，再向管内加入2
（6）待其温度降至约37℃时（可以用皮肤加以感知），加入预备的细胞悬液80μl（即8000cells
（7）每孔加入1.2ml含有细胞的混合液，使其混合均匀，待凝。
（8）等上层胶凝固后，每孔再加入1ml DMEM培养基，防止蒸发。
（9）将6孔板标记分组并记录种板时间并置于37℃、5%CO2培养箱培养。
（10）约两个星期后，显微镜下观察细胞集落形成，计数并拍照。
2.2.8细胞迁移实验
（1）将对于对数生长期的细胞用胰酶消化后加入纯的DMEM培养基混合终止消化，同时湿润小室薄膜。收集细
（2）离心后用DMEN培养基重悬细胞沉淀并计数，根据计数结果用DMEM稀释细胞浓度至2×105cel
（3）吸净之前小室内的培养基，将Transwell小室放入板中，用移液器沿板壁缓慢加入500μl含1
（4）将24孔板置于放入37℃、5%CO2培养箱培养24h。
（5）显微镜下可以看到迁移过Transwell薄膜的细胞，此时用棉签拭净小室内壁。
（6）再次用PBS擦拭小室内壁两次，注意不要误碰触薄膜底部，待干。
（7）加入含甲醛的结晶紫染液染色半小时。
（8）再用PBS及棉签仔细清洁小室两遍，待干。
（9）显微镜下观察晾干后的Transwell小室，计数并拍照。
2.2.9侵袭实验：
（1）将Matrigel基质胶预先放在4℃环境融化，实验前将枪头盒EP放在冰上并紫外消毒。
（2）取70μl Matrigel基质胶加入EP管中，再加入210μl不含FBS的培养基，混匀。
（3）将小室内培养基弃去，取30μl上述制备胶均匀铺于小室内。
（4）将24孔板放入培养箱30min待基质胶凝。
（5）细胞消化后加入纯的DMEM培养基混合终止消化，同时湿润小室薄膜。收集细胞悬液于EP管中，900
（6）离心后用DMEN培养基重悬细胞沉淀并计数，根据计数结果用DMEM稀释细胞浓度至2×105cel
（7）吸净之前小室内的培养基，将Transwell小室放入板中，用移液器沿板壁缓慢加入500μl含1
（8）将24孔板置于放入37℃、5%CO2培养箱培养24h。
（9）显微镜下可以看到迁移过Transwell薄膜的细胞，此时用棉签拭净小室内壁。
（10）再次用PBS擦拭小室内壁两次，注意不要误碰触薄膜底部，待干。
（11）加入含甲醛的结晶紫染液染色半小时。
（12）再用PBS及棉签仔细清洁小室两遍，待干。
（13）显微镜下观察晾干后的Transwell小室，计数并拍照。
2.2.10裸鼠成瘤实验：
（1）购买的24只4周龄雌性Balb/c裸鼠随机分为四组，每组6只小鼠，分别记为U87组，U87-N
（2）将容器盒，1ml注射器等实验所需器械提前经紫外线消毒。U87细胞常规消化后离心，PBS重悬并计
（3）将各组细胞悬液转移至预冷的EP管中，封口置于冰上。
（4）细胞准备完毕后尽快带着实验细胞和实验器材至SPF级动物房内，经紫外屏障再次消毒后进入动物实验室
（5）用移液器将管内细胞悬浮液充分混匀后，将小鼠右侧腋窝处用酒精擦拭消毒，各组细胞用1ml注射器注入
（6）注射细胞后，每天观察小鼠状态及肿瘤生长情况。当有小鼠腋窝皮下有肿物出现时，一星期两次记录肿物的
（7）待小鼠饲养至28天时，肿瘤最长径达到20mm左右时，采取CO2吸入法处死小鼠。
（8）将处死的小鼠分组拍照，解剖取出肿瘤组织计量其大小称重并拍照。继续解剖小鼠，观察脑，肝脏，肾脏，
2.2.11免疫组化实验：
（1）石蜡包埋:将上述福尔马林浸泡过的肿瘤组织置于自动脱水机进行脱水浸蜡处理，再将组织置于模具内，倒
（2）切片：冷却的含组织的固体石蜡固定于切片机上，设置切片机切片厚度为5μm，切片后用载玻片在水浴锅
（3）脱蜡复水：上述各组切片依次两道二甲苯溶液各15min，两道100%乙醇各10min，梯度浓度为
（4）抗原修复：组织切片浸在柠檬酸盐液中高火加热8min，取出常温放置3min后再次高温加热3min
（5）载玻片用PBS清洗3次，每次5min，在用3%H2O2溶液淬灭5min，阻断内源性过氧化物酶活
（6）再用PBS清洗两次，每次5min。滴加配制好的一定浓度的一抗稀释液，覆盖完全载玻片上的肿瘤组织
（7）PBS清洗3次，每次5min，滴加二抗，常温孵育20min。
（8）PBS清洗3次，每次5min，滴加DAB染色液。
（9）PBS清洗，苏木素染液复染1min，水洗后镜下观察核染效果，置于自来水中返蓝30min，自然风
（10）滴加松脂油后加盖玻片封片。
（11）显微镜下观察并拍照。
（12）统计分析：Ki-67和p-CREB是核内表达蛋白，随机取10各高倍视野计数阳性细胞数和总细胞
2.2.12统计分析:
采用GraphPad Prism 6软件分析实验数据。所有数据均来自≥3次独立实验，并以平均值±标准
3.结果
为了确定激活突变SHP2蛋白对神经胶质瘤细胞的作用，我们用重组慢病毒载体阴性对照载体（LV-NC），
图1 SHP2蛋白在胶质瘤细胞系A172和U87中稳定表达
Fig 1. SHP2 protein expressed in transfected A172
3.2激活突变SHP2对胶质母细胞瘤细胞的恶性生物学行为的影响
3.2.1激活突变SHP2增强了胶质母细胞瘤细胞的增殖能力
增殖能力的大小是衡量肿瘤细胞恶性程度的一个重要因素。为了检测激活突变SHP2对神经胶质瘤细胞增殖能力
图2 激活突变的SHP2增强胶质瘤细胞的增殖能力
Fig 2.GOF-mutant SHP2 promotes proliferation abili
3.2.2激活突变SHP2促进胶质瘤细胞周期转化
细胞周期是调控细胞的基本生命活动过程，细胞周期调控的异常或紊乱可以导致肿瘤的发生。我们猜想：激活突变
图3 激活突变SHP2促进胶质瘤细胞周期由G1期向S期转化
Fig 3.Activation of mutant SHP2 promotes glioblast
3.2.3激活突变的SHP2增强胶质母细胞瘤细胞的平板克隆形成能力
平板克隆实验检测细胞的群体依赖性和增殖能力，单个细胞条件下存活并具有增殖能力是肿瘤细胞的重要特性。因
图4 激活突变的SHP2增强了胶质瘤细胞的平板克隆形成能力
Fig 4. GOF-mutant SHP2 promotes colony formation a
3.2.4激活突变SHP2增强了神经胶质瘤细胞的软琼脂克隆形成能力
软琼脂集落形成实验模拟肿瘤细胞在体内半固液的环境，其克隆形成能力可以反映肿瘤细胞的恶性程度。首先配制
图5 激活突变的SHP2增强胶质瘤细胞的软琼脂集落形成能力
Fig 5. Activation of mutated SHP2 promotes soft ag
肿瘤转移是指肿瘤细胞由原发部位通过各种途径转移到其他部位继续生长，是肿瘤细胞恶变途径。我们利用Tra
图6 激活突变的SHP2神经胶质瘤细胞的迁移能力
Fig 6. Activation of mutated SHP2 promotes migrati
3.2.6激活突变的SHP2增强神经胶质瘤细胞的侵袭能力
恶性肿瘤后期的侵袭性生长和远处转移往往是很多患者失去手术机会且预后较差的重要因素，因此我们利用Mat
图7 激活突变的SHP2增强神经胶质瘤的侵袭能力
Fig 7. Activation of mutated SHP2 promotes migrati
3.3激活突变的SHP2蛋白可能通过ERK/CREB信号通路的活化促进神经胶质瘤细胞的恶性转化
异常表达的SHP2常常引起ERK蛋白的激活，而ERK是调节细胞各种生命活动如介导转录活化，影响细胞增
图8 激活突变的SHP2增强胶质瘤细胞中ERK/CREB信号通路的相关蛋白
Fig 8. Activating mutant SHP2 enhances the ERK/CRE
3.4激活突变SHP2对U87细胞的裸鼠成瘤能力的影响及机制研究
3.4.1激活突变SHP2增强了U87细胞的裸鼠成瘤能力
从上述细胞行为学结果我们可以看出，突变的SHP2增强了神经胶质瘤细胞的增殖，迁移和侵袭的能力，为了进
图9激活突变的SHP2促进神经胶质瘤细胞的裸鼠成瘤能力
Fig 9. Activating mutant SHP2 promotes glioblastom
3.4.2激活突变SHP2肿瘤组织中p-ERK和p-CREB蛋白表达相对增加
为了进一步探究激活突变SHP2促进胶质瘤细胞裸鼠成瘤能力的相关机制，我们利用免疫组化实验检测各组肿瘤
图10 激活突变组肿瘤组织中的p-ERK和p-CREB表达增加
Fig 10. The expression p-ERK and p-CREB is increas
3.5 U0126抑制胶质母细胞瘤SHP2组p-ERK和p-CREB蛋白的表达
上面实验结果表明激活突变SHP2可能是通过激活ERK/CREB信号通路增强神经胶质瘤细胞的恶性生物学
图11 U0126降低了SHP2突变组p-ERK和p-CREB蛋白的表达
Fig 11. U0126 decreases p-ERK and p-CREB protein e
3.6 U0126对激活突变SHP2组胶质母细胞瘤的生物学行为的影响
3.6.1 U0126削弱了激活突变SHP2组胶质母细胞瘤的增殖能力
既然U0126可以降低激活突变SHP2细胞中p-ERK和p-CREB的表达，那其对野生型和突变型SH
图12 U0126降低了激活突变SHP2细胞的增殖能力
Fig 12. U0126 reduces proliferation ability of act
3.6.2 U0126抑制了激活突变SHP2组细胞的平板克隆形成能力
为了检测U0126对激活突变的SHP2组细胞的平板克隆形成能力是否产生影响，我们分别检测WT-SHP
图13 U0126抑制了神经胶质瘤细胞的平板克隆形成能力
Fig 13. U0126 inhibits platelet clonogenic capacit
3.6.3 U0126部分抑制了激活突变SHP2组胶质母细胞瘤细胞的迁移能力
为了检测U0126对激活突变的SHP2组细胞的迁移能力是否产生影响，我们利用Transwell小室系
图14 U0126抑制了激活突变SHP2神经胶质瘤细胞的迁移能力
Fig 14. U0126 inhibits migration of activated muta
5.结论
