疏绵状嗜热丝孢菌热稳定纤维素酶的分离纯化和基因克隆

摘要

纤维素酶是一组能降解纤维素的酶的总称。该酶广泛存在于各种微生物中，如细菌、真菌、放线菌等；此外，在动物中也发现该酶的存在。但到目前为止，对该酶的研究仍多以中温好气性木霉(Trichoderma)为主。因此，为了提高纤维素酶的产率和加速对纤维素酶降解纤维素机制的研究，一些极端条件下高活力的纤维素分解菌已经引起科研工作者的重视，尤其是对嗜热真菌(thermophilic fungi)的研究。嗜热真菌具有产酶快且产量大、分解纤维素效率高等特性，是一类非常具有开发潜力的纤维素分解菌。 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种广泛分布的，生长上限温度较高的一种嗜热真菌，本实验室从该菌中已分离了多种嗜热酶，但还未分离到β-葡萄糖苷酶和外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶。本研究中Thermomyces lanuginosus在以微晶纤维素为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶，通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。经12.5％SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法测得两种酶的分子量大小分别约为46.6kDa和47kDa及118kDa和120kDa。 外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶的反应最适温度为60℃，最适pH值为5.0，在60℃保温30min活性丧失5％，在70℃时的半衰期为35min，在80V保温10min仍具有60％的活性，80℃下酶的半衰期为25min，在90℃下保温10min仍有12％的活性。Na<'+>K<'+>、Mn<'3+>对外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶活性影响不大；Ca<'2+>、Ba<'2+>、Mg<'2+>离子对酶有明显的激活作用，Ag<'+>、Zn<'2+>、NH<,4><'+>等对酶有抑制作用。该酶的Km值为9.56 mg/mL,Vmax为22.12 mg/mL.min。 β-葡萄糖苷酶的反应最适温度为60℃，最适pH值为5.0，在60℃保温1小时活性基本不丧失，在70℃的半衰期是15min，在80℃保温10min仍具有30％的活性。在90℃下保温10min仍有10％的活性。Ca<'2+>、Ba<'2+>、 Mg<'2+>对β-葡萄糖苷酶有激活作用，Na<'+>、K<'+>、Mn<'2+>对酶活性影响不大，而Ag<'+>、NH<,4><'+>、Zn<'2+>对酶有显著的抑制作用。该酶的Km值为1.98mg/mL，Vmax为11.94mg/mL.min。 根据12种真菌热稳定外切葡聚糖酶的同源保守序列设计兼并性引物，通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法，克隆了疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyceslanuginosus外切葡聚糖酶的编码基因cbh，全长cDNA为1710bp，包含一个由457个氨基酸组成的开放阅读框。通过Signal．P服务器的SignalP-NN和SignalP-HNN两种软件我们对推测的外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶基因氨基酸序列进行了信号肽分析，结果发现外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶基因cbh有一个信号肽切割位点，其位置为1-17，序列为MYQRALLFSFFLAAARA，说明该酶是一种分泌型的蛋白。

目录

声明

英文缩略词及中文对照表

第一章纤维素酶的研究进展

引言

1.纤维素的降解

2.纤维素酶的研究进展

2.1纤维素酶系的组成

2.2纤维素酶的主要来源

2.3纤维素酶的生产

2.4纤维素酶的结构

2.5纤维素酶的作用机理

2.6纤维素酶的应用

2.7纤维素酶的纯化研究

2.8纤维素酶的主要性质

2.9纤维素酶的活力测定

2.10纤维素酶基因的克隆

2.11纤维素酶基因的表达

2.12纤维素酶研究展望

3.本研究的立题依据意义与研究内容

3.1研究的目的意义

3.2研究的主要的研究内容

3.3技术路线

第二章疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)热稳定外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶的纯化及特性

1.材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1不同培养时间对外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶酶活性的影响

2.2疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶的分离纯化及鉴定

2.3外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶的主要性质

3讨论

3.1关于研究结果

3.2关于Thermomyces lanuginosus外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶的纯化方法

3.3今后还应开展的工作

4结论

第三章疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)热稳定β-葡萄糖苷酶的纯化及特性

引言

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2.结果与分析

2.1不同培养时间对疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)产生β-葡萄糖苷酶的影响

2.2疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)β-葡萄糖苷酶的分离纯化及鉴定

2.3 β-葡萄糖苷酶的一般性质

3讨论

3.1关于研究方法

3.2关于纯化研究结果

3.3关于Thermomyces lanuginosus β-葡萄糖苷酶的稳定性

3.4关于Thermomyces lanuginosus β-葡萄糖苷酶的活性与金属离子的关系

3.3今后还应开展的工作

4结论

第四章疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus热稳定外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶基因的cDNA克隆及其序列分析

引言

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1 Thermomyces lanuginosus总RNA的提取

2.2 Thermomyces lanuginosus外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶基因的分离

2.3外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析

3讨论

3.1外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶cbh的结构

3.2利用RACE技术分离基因

第五章结论和建议

结论

建议

参考文献

攻读学位期间发表论文情况

致谢