乳腺癌HSP70-HER谱对诱导自体特异性CD8+NKT细胞活性的影响

摘要

目的：通过探索高质量人乳腺癌细胞原代培养方法及乳腺癌HSP70-HER蛋白复合物的分离纯化鉴定方法，在此基础上根据HER家族各成员蛋白在乳腺癌患者中表达情况的不同应用酶联免疫吸附测定法建立人乳腺癌HSP70-HER谱。根据建立的谱诱导自体HSP70-HER特异性CD8+NKT细胞，并检测其抗肿瘤活性，通过对比人乳腺癌HSP70-HER谱中各组间存在的差异，最终确定需要人工干预的目标抗原肽，对其进行人工干预，以提高自体抗原抗肿瘤活性的能力。　　方法：选取符合实验条件并签署知情同意的乳腺癌患者术后组织，通过清洗、消化、计数、活率检测、接种、传代、冻存、复苏等过程进行乳腺癌术后组织原代培养。调整细胞数量至5*106，进行热休克（42℃）、裂解、超声破碎、超速离心、ConA Sepharose亲和层和ADP agarose亲和层析分离纯化HSP70-HER蛋白复合物，应用Bradford法、SDS-PAGE电泳法、Western-blot法、免疫斑点实验、ELISA方法等对纯化的HSP70-HER蛋白复合物进行定量、定性鉴定，进而完善人乳腺癌HSP70-HER谱。通过乳酸脱氢酶释放法检测不同HSP70-HER诱导自体特异性CD8+NKT细胞的抗肿瘤活性，进而明确谱中各组的免疫活性。通过对谱中各组间的对比进而明确需要人工干预的目标抗原肽，通过人工干预目标抗原肽，减弱或消除肿瘤患者免疫耐受，增强特异性免疫细胞抗肿瘤活性。　　结果：改进并提高了人乳腺癌细胞原代培养成功率及活细胞检出比率。与此同时，得到了纯度较高的HSP70-HER蛋白复合物。通过对比各种实验方法，最终确定应用ELISA方法检测乳腺癌HSP70-HER蛋白复合物中HER家族蛋白的含量并建立HSP70-HER谱。　　结果显示，自164例乳腺癌原代细胞纯化的HSP70-HER蛋白复合物中HER-1蛋白的含量范围：32946.3-156492.8pg（平均数为83092.7pg）；HER-2蛋白的含量范围：28590.2-176689.7pg（平均数为57046.2pg）；HER-3蛋白的含量范围：0-6812.3pg（平均数为4325.8pg）；HER-4蛋白的含量范围：13860.9-103632.5pg（平均数为62732.4pg）。HER-3蛋白的含量明显低于其它3种蛋白。以平均数为标准，将四种蛋白按照含量高低进行标记，高于平均数的标记为（+），低于平均数的标记为（-），根据标记情况，将HSP70-HER蛋白复合物进行分组，初步建立了乳腺癌HSP70-HER谱。应用乳酸脱氢酶释放法检测不同HSP70-HER诱导自体特异性CD8+NKT细胞的抗肿瘤活性，进而明确谱中各组的免疫活性。最终发现在乳腺癌HSP70-HER谱中，自体HSP70-HER蛋白复合物抗肿瘤活性较差的主要为6组，分别为：第3组HER-1(+)HER-2(+)HER-3(-)HER-4(+)；第7组HER-1(+)HER-2(-)HER-3(-)HER-4(+);第8组HER-1(+)HER-2(-)HER-3(-)HER-4(-);第12组HER-1(-)HER-2(+)HER-3(-)HER-4(-);第15组HER-1(-)HER-2(-)HER-3(-)HER-4(+);第16组HER-1(-)HER-2(-)HER-3(-)HER-4(-)。将这几组暂定为人工干预对象，经过观察发现，这几组共性为HER-3蛋白阴性表达，最终确定体外制备重组人HSP70-HER-3蛋白复合物进行人工干预。通过人工干预实验证明体外重组的HSP70-HER-3蛋白复合物具有增强人乳腺癌HSP70-HER谱中HER-3阴性组别的自体抗原抗肿瘤活性的能力。　　结论：通过探索及改进实验方法重新确立了乳腺癌HSP70-HER谱，对上述谱中自体抗原免疫活性差的组别进行抗肿瘤活性的检测最终确定了需要人工干预的目标抗原肽（HSP70-HER-3蛋白复合物）。人工干预实验证明体外重组的HSP70-HER-3蛋白复合物具有增强人乳腺癌HSP70-HER谱中HER-3阴性组别的自体抗原抗肿瘤活性的能力。

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