鲍曼不动杆菌外膜蛋白W在临床分离株中的表达及其致病性研究

摘要

目的：以鲍曼不动杆菌临床分离株为研究对象，研究外膜蛋白W（OmpW）在不同临床分离株中的表达是否存在差异；同步克隆表达重组蛋白OmpW并对其体外致病特征进行初步研究，为进一步阐明多重耐药鲍曼不动杆菌耐药机制和寻找抗感染靶点提供新的实验数据和思路。　　方法：1.人工合成多肽抗原，通过动物免疫得到抗血清，获取抗OmpW蛋白多克隆抗体，鉴定后纯化该多克隆抗体。2.选取临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌31株（耐药组）及碳青霉烯类抗生素敏感株30株（敏感组），通过蛋白印迹法（Western Blot）检测2组分离株中OmpW蛋白表达情况。3.以鲍曼不动杆菌临床株A1和标准菌株ATCC19606为模板，通过PCR方法扩增ompW和ompA基因，构建原核表达载体，经测序验证后，筛选阳性克隆表达重组蛋白OmpW和OmpA进行蛋白纯化。4.重组蛋白OmpW和OmpA分别与人喉癌细胞株Hep-2进行培养，同步采用JC-1和DAPI荧光染料检测Hep-2细胞凋亡情况。　　结果：1.人工偶联多肽的蓝色载体构建成功，经临床分离鲍曼不动杆菌菌体蛋白验证，在抗血清中得到抗OmpW蛋白的多克隆抗体。2.经过Western Blot检测，鲍曼不动杆菌耐药组OmpW蛋白表达阳性率100％，敏感组的OmpW蛋白表达阳性率63.33%，耐药组和敏感组OmpW蛋白表达量分布存在显著差异，经过Fisher确切概率法检验，χ2=12.359，P=0.000<0.01，差异有统计学意义。3.成功构建原核表达载体，经过基因测序验证，在原核表达系统（pET30a/ompW、pET30a/ompA）中高表达，基因分子量分别为987bp和966bp，大小与预期值相符。表达产物经尿素和Tris-HCl处理纯化，得到高纯度的重组蛋白OmpW和OmpA，分子量分别为42kD和41kD。4.在Hep-2细胞凋亡实验中，外膜蛋白OmpW和OmpA与细胞作用后，JC-1染料检测绿色荧光明显增多，提示两种蛋白都有诱导Hep-2细胞凋亡作用，DAPI染料检测蓝色荧光明显增多，提示两种蛋白都可以导致Hep-2细胞发生凋亡。　　结论：1.鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药株OmpW蛋白表达量明显高于敏感株。2.外膜蛋白OmpW可体外诱导Hep-2细胞发生凋亡，提示OmpW通过特定途径参与多重耐药鲍曼不动杆菌致病过程，但具体机制仍需要进一步研究。

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前言

材料和方法

1.材料

2.方法

结果

1.OmpW蛋白多克隆抗体制备

2.临床株OmpW蛋白表达情况

3.OmpW和OmpA重组蛋白的获得

4.OmpW和OmpA蛋白体外致病特征

讨论

参考文献

文 献 综 述:鲍曼不动杆菌外膜蛋白和耐药及致病机制相关性的研究进展

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