EGF通过间隙连接蛋白调控卵母细胞成熟的研究

摘要

目的：　　对表皮生长因子（EGF）促进小鼠卵母细胞减数分裂恢复、促进卵母细胞成熟机理进行研究探讨。　　方法：　　利用RT-PCR技术检测与卵母细胞成熟、胚胎发育相关的11种间隙连接蛋白（Connexin，Cx）在小鼠未成熟卵母细胞复合体（COCs）和成熟COCs中的表达情况；利用免疫组化结合激光共聚焦技术研究Cx43在未成熟COCs和成熟COCs颗粒细胞、卵母细胞中的表达部位。将超促排卵得到的未成熟COCs培养于含有或不含有EGF的HX-M199培养液中，制备EGF诱导小鼠COCs减数分裂恢复的动力学曲线，比较不同浓度EGF促进小鼠COCs发生减数分裂恢复的效率，通过添加EGFR特异性抑制剂AG研究EGF是否通过EGFR发挥作用。通过Western blotting技术检测EGF作用后Cx43的磷酸化水平，确定EGF是否促进Cx43发生磷酸化，使颗粒细胞与卵母细胞间的间隙连接通讯（GJIC）关闭，阻断抑制卵母细胞减数分裂恢复信号物质的传递，使小鼠卵母细胞成熟。　　结果：　　1.在未成熟卵母细胞复合体中，有8种间隙连接蛋白Cx30、Cx30.3、Cx31、Cx31.1、Cx37、Cx40、Cx43和Cx45表达，其中Cx37、Cx43和Cx45高度表达，Cx31、Cx31.1中度表达，Cx30、Cx30.3和Cx40低度表达。在成熟卵母细胞复合体中，间隙连接蛋白表达种类和表达量均有减少，仅有4种间隙连接蛋白Cx32、Cx37、Cx43和Cx45表达，其中Cx43和Cx45高度表达，Cx37中度表达，Cx32低度表达。说明Cx在抑制小鼠卵母细胞成熟中起着重要作用。　　2.在未成熟COCs中Cx43高表达于颗粒细胞细胞膜上，在卵母细胞细胞膜和透明带上也有高表达，以簇状分布。在成熟的COCs颗粒细胞中Cx43表达量降低，仍然分布于细胞膜上，在卵母细胞中Cx43的表达量亦减少，均匀分布于细胞膜上，在透明带上不表达。　　3.与对照组比较，EGF能有效的促进小鼠卵母细胞的成熟，且具有时间依赖性和剂量选择性，10ug/mlEGF培养24h作用效果最好，GVBD发生率达到86.2％。EGF不能促进裸卵减数分裂的恢复。EGFR特异性抑制剂AG能有效逆转EGF促进的小鼠卵母细胞减数分裂的恢复，且1ug/mlAG逆转效果最好。　　4.在卵母细胞成熟过程中，均有Cx43磷酸化和非磷酸化形式存在，在未成熟COCs中，Cx43以非磷酸化形式为主，添加EGF后，仅仅培养10min，Cx43就以磷酸化形式为主，并且持续1小时，培养到2h时，Cx43又以磷酸化和非磷酸化两种形式存在。　　结论：　　在小鼠未成熟COCs中，多种Cx在颗粒细胞和卵母细胞细胞膜上表达，在颗粒细胞间、颗粒细胞与卵母细胞间形成了GJIC。EGF能够促进小鼠卵母细胞的成熟，其作用机制可能是EGF与颗粒细胞中的EGFR结合，快速促使小鼠颗粒细胞和卵母细胞中Cx43发生磷酸化，GJIC关闭，阻断了抑制卵母细胞成熟的信号物质cAMP和cGMP从颗粒细胞向卵母细胞的输入，卵母细胞中cAMP和cGMP浓度降低，减数分裂恢复，卵母细胞走向成熟。

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前言

1 材料

1.1 主要仪器设备

1.2 实验动物

1.3 实验试剂及耗材

1.4 试剂配制

2 实验方法

2.1 小鼠卵母细胞复合物( COCs)的获得

2.2 RT-PCR 检测未成熟和成熟卵母细胞复合体中Cx30、Cx30.3、Cx31、Cx32、Cx36、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx57基因的表达

2.3 免疫组化

2.4卵母细胞成熟培养

2.5 EGF促进卵母细胞成熟

2.6 EGF和AG对小鼠卵母细胞成熟的影响

2.7 Western blot检测EGF处理后卵母细胞中Cx43磷酸化的情况

2.8数据进行统计学分析

3 结果

3.1 卵母细胞复合体中间隙连接蛋白的表达

3.2 不同发育时期卵母细胞复合体中Cx43的表达

3.3 EGF促进卵母细胞成熟

3.4 不同浓度EGF对COC恢复减数分裂的作用

3.5 EGF对小鼠COCs中Cx43磷酸化的影响

4 讨论

4.1 间隙连接蛋白在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达

4.2 EGF促进小鼠COCs减数分裂恢复的研究

4.3 EGF促进小鼠COCs减数分裂恢复机制的研究

5结论

参考文献

文献综述：间隙连接蛋白在生殖系统领域的研究进展

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