他米巴罗汀调控免疫应答在实验性牙周炎中的作用研究

摘要

目的:　　本研究采用高毒力株牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingival is，P.gingivalis)W83口腔感染方法建立小鼠牙周病模型，明确牙周炎发生时口腔微环境及系统免疫状况。观察他米巴罗汀（tamibarotene，国际通称Am80）对牙周组织及系统免疫器官中调节性T(regulatoryT，Treg)和辅助性T(T helper，Th)17细胞数量、表型的影响，并进一步探讨Am80对破骨细胞前体细胞RAW264.7的调控作用。从而分析Am80免疫调节治疗牙周病的可行性和相关的作用机制，为牙周病的免疫防治提供新的思路和理论依据。　　方法:　　1、Am80对牙周炎小鼠口腔微环境免疫应答的影响及相关机制初探　　将SPF级C57BL/6雌性小鼠按随机数字表法分为5组:A组为正常对照组;B组为牙周炎组;C组为低剂量(10μg/d) Am80治疗组，D组为中剂量(50μg/d)Am80治疗组，E组为高剂量(100μg/d) Am80治疗组。牙周炎模型以涂抹牙周致病菌P.gingivalis的方法建立。通过解剖显微镜测量观察各组小鼠磨牙牙齿松动度，计算牙槽骨吸收率;利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)间接法检测血清抗P.gingivalisW83特异性IgG;应用实时定量反转录-聚合酶链反应(Realtime reverse transcription-polymerase chain reaction，RealtimeRT-PCR)技术分析牙龈组织、颈部淋巴结和脾脏中白介素(interleukin，IL)12和干扰素(interferon，IFN)γ的mRNA相对表达水平。　　2、Am80调节口腔局部牙周组织中Treg/Th17细胞免疫平衡改善牙周炎　　选用健康BABL/c(H-2d)雌性小鼠分为:正常对照组、牙周炎组和Am80治疗组;以1×1010(Colony-Forming Units，CFU)/ml P.gingivalis W83连续7天感染小鼠口腔，建立牙周炎动物模型;治疗组给予每只小鼠50μg/d Am80。持续监测小鼠体重变化，于感染后的第4周取材。检测小鼠血清中谷草转氨酶(aspartateaminotransferase，AST)，谷丙转氨酶(alanine amino transferase，ALT)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的水平，评估各组小鼠肝脏功能;通过解剖显微镜测量从釉牙骨质界(cemento-enamel junction，CEJ)到牙槽嵴顶的距离(alveolar bonecrest，ABC)评价牙槽骨吸收情况;采用苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin，HE)染色的方法观察牙周组织中结缔组织附着丧失和组织炎症细胞浸润情况，并利用抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色评价牙周骨组织中破骨细细胞浸润状况;流式细胞仪检测牙周组织淋巴细胞、颈部引流淋巴结、脾脏中Treg和Th17细胞及转录因子的比率;Realtime PCR技术分析不同组织淋巴细胞中IL-10、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)β、IL-17、核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa betaligand，RANKL)、IL-6、IL-1β和单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic factor-1，MCP-1)的mRNA表达水平。　　3、Am80对P.gingivalis W83抗原刺激RAW264.7细胞增殖能力的研究　　利用破骨细胞前体细胞RAW264.7，以1×104/ml细胞密度接种于96孔板，待细胞完全贴壁后随机分为正常对照组、不同浓度的Am80(1 nM、5nM、10nM、50nM、100 nM)处理组、P.gingivalis抗原组和P.gingivalis抗原与不同浓度Am80联合处理组。P.gingivalis抗原组即给予浓度为5×106的灭活抗原刺激细胞;抗原+Am80联合处理组即给予抗原和不同浓度的Am80同时培养;利用MTS法检测24 h细胞相对增殖率。倒置显微镜下观察10 nM Am80对抗原刺激的RAW264.7细胞形态的影响;ELISA检测细胞培养上清中Am80对P.gingivalis抗原刺激RAW264.7细胞释放IL-10的影响。　　结果:　　1、Am80调控牙周炎小鼠口腔微环境免疫应答减轻牙周骨吸收　　(1)不同浓度的Am80治疗组间牙槽嵴顶到釉牙骨质界的总距离随着浓度的增加显著减少，在10-100μg/d范围内呈浓度依赖趋势;并且与牙周炎组相比，Am80治疗组的牙齿松动度显著减小;　　(2)经过高、中、低浓度的Am80治疗后，Am80在不同程度上均降低了抗Pg w83特异性IgG的表达，其中以50μg/d和100μg/d最为显著;　　(3)随着Am80治疗组使用浓度的增高，Am80不同程度降低了牙周炎小鼠牙龈组织、淋巴结和脾脏中IL-12和IFN-γ mRNA表达，其中以100μg/d治疗组抑制能力最为显著。　　2、Am80通过调控局部牙周组织Treg/Th17免疫失衡抑制牙周炎　　(1)实验结束后，各组小鼠体重有略微增长，但无显著性差异（P＞0.05）。Am80对牙周炎小鼠与正常小鼠相比血清中AST、ALT和ALP的水平没有明显差异;　　(2)与牙周炎组相比，Am80治疗后小鼠牙槽骨表面破骨细胞数量明显减少，牙周组织炎性细胞浸润减少;　　(3)与牙周炎小鼠相比，应用Am80治疗显著增加了牙龈组织和颈部淋巴结CD4+Foxp3+细胞，同时显著降低了CD4+ROR-γt+细胞的比率。与牙周炎小鼠相比，应用Am80治疗显著降低了牙龈组织、颈部淋巴结和脾脏中RANKL、IL-17、IL-6、IL-1β和MCP-1 mRNA表达;并且在Am80治疗组牙龈组织和颈部淋巴结中，IL-10和TGF-β1 mRNA表达水平明显增加。　　3、Am80抑制由P.gingival isW83抗原刺激的RAW264.7细胞增殖能力　　(1)1 nM-100 nM实验浓度范围内Am80对RAW264.7细胞无毒性反应;P.gingivalis抗原刺激的RAW264.7细胞相对增殖率与正常组相比显著增加，低浓度的Am80不能影响抗原刺激细胞的增殖，10 nM浓度的Am80处理组细胞相对增殖率显著降低;P.gingivalis抗原刺激同时加入Am80(10 nM)处理后，细胞增殖明显减慢;　　(2) Am80处理抗原刺激组比单纯抗原组细胞培养上清中IL-10的浓度显著增加，说明Am80促进了P.gingivalis抗原刺激细胞中IL-10的表达。　　结论:　　1、在实验性牙周炎发病初期，Am80能够有效调控小鼠免疫应答，抑制效应细胞的活化并减少机体产生过激的免疫反应，从而抑制牙周骨吸收。　　2、P.gingivalis诱导牙周病损发生时，口腔局部炎症反应Th17/Treg免疫失衡状态比系统反应更严重。　　3、Am80调控牙周组织中的免疫细胞及其分泌细胞因子减轻炎症反应。　　4、Am80抑制由P.gingivalisW83抗原刺激的破骨细胞前体细胞RAW264.7增殖，提示Am80在体外抑制破骨细胞前体细胞分化的可能。

目录

声明

摘要

英文缩略词

论文一 他米巴罗汀对牙龈卟啉单胞菌诱导的牙周炎模型免疫应答影响的初探

前言

研究资料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 维甲酸激动剂Am80调节口腔局部Treg／Th17平衡改善牙周炎

前言

研究资料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 他米巴罗汀对牙龈卟啉单胞菌抗原刺激RAW264．7细胞的影响

前言

研究资料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 调节性T细胞及Th17细胞与牙周骨吸收研究进展

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