Wnt/β-catenin信号通路在氟致大鼠成骨细胞分化中的作用

摘要

氟是机体生命活动所必须的微量元素之一，长期摄入过量氟会造成机体牙齿、骨骼等硬组织的广泛损伤，氟斑牙和氟骨症是其特征性表现。慢性氟中毒可引起骨硬化、骨软化、骨质疏松和骨周软组织化骨等不同性质的病变，涉及参与骨转换的各种细胞，但成骨细胞功能活跃始终占主要地位。　　成骨细胞(osteoblast，OB)起源于间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)，成骨细胞发育和分化可简括为以下几个阶段:间充质干细胞(MSC)、骨祖细胞(progenitor cell)、前成骨细胞(preosteoblast)、成骨细胞(osteoblast，OB)，最后形成骨细胞(osteocyte)。成骨细胞是骨发生和骨形成的重要细胞，具有合成、分泌组成骨基质的胶原和糖蛋白的作用，并通过钙化基质形成骨基质。另外成骨细胞在维持机体内环境的稳定、生理机制调节和骨代谢性疾病中发挥重要作用。氟在体内长期大量蓄积，对成骨细胞的作用主要表现为成骨细胞功能明显活跃，不仅细胞数增多，而且细胞胞体肥大，DNA合成增加、各种骨形成标志物水平升高，呈明显活跃状态。对于氟致成骨细胞分化作用机制有研究发现可能是由于通过激活BMP、Runx2等信号通路而发挥作用，但其确切机制还需深入研究。　　近年来，Wnt信号通路在骨质疏松以及骨代谢性疾病中的研究日益增多，目前认为其具有促进成骨细胞增殖与分化并可抑制成骨细胞的程序性死亡等重要调节作用。我们的前期动物实验研究发现，氟中毒大鼠骨组织中β-cateninmRNA和蛋白表达量均增高，这提示Wnt/β-catenin信号通路可能参与了氟诱导的骨形成过程，但是Wnt/β-catenin信号通路在氟致大鼠成骨细胞增殖与分化中的确切机制还不十分清楚。因此，本实验采用原代培养的大鼠成骨细胞，给予一定剂量氟化钠处理后，研究氟是否激活原代大鼠成骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路，并进一步探讨Wnt/β-catenin信号通路在氟致成骨细胞分化过程中所起作用。　　材料与方法：　　一、实验方法　　（一）原代细胞培养　　取新生24 h内Wistar大鼠乳鼠（雌雄不限，中国医科大学动物部提供），采用分段胶原酶消化法消化乳鼠颅盖骨细胞，常规接种培养于α-MEM培养基（含10％胎牛血清），5％ CO2、37℃条件下培养。　　（二）细胞增殖检测　　采用MTT比色法，实验分为对照组和6个染氟组，每组设置8个平行样。用酶标仪测定各孔的光密度(OD)值，并计算细胞存活率[细胞存活率=[（染氟组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100％]。　　（三）碱性磷酸酶(ALP)染色　　用ALP染色试剂盒检测成骨细胞中ALP表达情况，显微镜(50×)下可见，成骨细胞质内呈现的蓝色、不容、颗粒状即为ALP阳性表达。　　（四）成骨细胞荧光免疫化学检测　　采用免疫荧光细胞化学方法，用荧光显微镜(400×)观察对照组、10-7M NaF染毒组成骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin入核表达情况。　　（五）提取成骨细胞mRNA进行目的基因mRNA表达水平检测　　RNAiso试剂盒提取细胞中mRNA，按照PrimeScript(R) RT reagent Kit说明书反转录得到cDNA，SYBR(R) Premix Ex TaqTMⅡ说明书进行实时定量聚合酶链式反应，通过数据分析目的基因mRNA表达水平。　　（六）蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白表达量　　用蛋白裂解液裂解细胞，用Bio-Rad Protein assay试剂盒测定蛋白浓度，采用蛋白免疫印迹法检测成骨细胞中Wnt信号通路相关因子蛋白表达量。　　二、统计学处理　　全部数据采用SPSS16.0统计学软件进行分析，数据以（(x)±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，p＜0.05（*）或p＜0.01(**)为差异具有统计学意义。　　结果：　　（一）氟促进成骨细胞增殖　　108～10-3M NaF处理成骨细胞72 h后，NaF浓度为10-8 M时细胞增殖能力与对照组比较开始升高，在10-6M、10-5 M时成骨细胞增殖能力升高最为显著(p＜0.05)，而在10-3M组成骨细胞增殖能力与10-4M组比较有下降趋势，并接近于对照组细胞增殖水平。　　（二）NaF对成骨细胞早期分化标志物的影响　　ALP染色结果表明，与对照组比较，10-7～10-4M浓度的氟化钠处理7d后，碱性磷酸酶阳性表达的成骨细胞数量显著升高。Real-time PCR结果显示，染氟10-7～10-4M浓度成骨细胞中ALP、COL1A1、骨连素(Osteonectin) mRNA表达量显著高于对照组。　　（三）氟可促进Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin mRNA及蛋白表达且促进β-catenin入核表达　　Real-time PCR和Western blot方法检测β-catenin mRNA和蛋白表达量，在染氟10-7～10-5M浓度范围内，5d后β-catenin mRNA表达量与对照组比较升高，其中在染氟10-6M时，表达量最高。10-7M、10-6M氟化钠处理成骨细胞72 h后，β-catenin蛋白表达量与对照组比较升高，且在10-7M水平蛋白表达量升高最为明显。免疫荧光方法检测结果表明，成骨细胞染氟10-7M，72 h后可显著增加β-catenin蛋白入核表达量。　　（四）氟促进成骨细胞中Akt、GSK3β磷酸化，激活经典Wnt/β-catenin信号通路　　用10-7 M氟化物处理成骨细胞24 h、48 h、72 h后，蛋白免疫印迹法检测p-GSK3β(Ser-9)，结果显示氟可增加GSK3β的磷酸化水平，并随染氟时间增加磷酸化水平增强。同样方法处理成骨细胞后，检测p-Akt(Ser-473)蛋白表达量，结果显示氟促进p-Akt表达水平，且随染氟时间延长p-Akt表达呈逐渐升高趋势。　　（五）DKK-1对氟诱导成骨细胞GSK3β磷酸化以及β-catenin蛋白表达的抑制情况　　成骨细胞用0.5μg/ml DKK-1预处理1h后，再用10-7M氟化钠处理细胞72h，检测p-GSK3β、β-catenin蛋白变化情况。结果显示，DKK-1显著降低了氟诱导p-GSK3β、β-catenin蛋白表达水平。　　（六）氟通过激活经典Wnt信号通路而诱导成骨细胞分化　　用0.5μg/ml DKK-1预处理成骨细胞1h后，10-7M NaF处理细胞72 h，结果显示，DKK-1显著降低了氟诱导ALP蛋白以及ALP、COL1A1、骨连素mRNA表达水平。　　（七）氟诱导成骨细胞中Runx2表达　　用10-7M、10-6M氟化物处理成骨细胞5d后，与对照组比较，Runx2 mRNA表达水平显著升高;染氟10-6M，48 h后Runx2蛋白表达量与对照组比较显著升高。用DKK-1预处理细胞1h后染毒，氟诱导Runx2基因与蛋白表达的作用被DKK-1所抑制。　　结论：　　1.一定剂量的氟可促进原代培养大鼠成骨细胞增殖与分化　　2.一定剂量的氟可促进成骨细胞中Akt、GSK3β磷酸化从而激活Wnt/β-catenin信号通路。　　3.Wnt/β-catenin信号通路参与了氟诱导成骨细胞分化过程。

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摘要

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前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 氟对骨形成过程中成骨细胞的影响及作用机制

在学期间科研成绩

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