乳斑缺氧微环境调控胃癌干细胞样细胞自我更新能力促进腹膜转移的机制研究

摘要

前言：　　腹膜转移是胃癌最常见的转移形式之一，是导致进展期胃癌根治手术失败的主要因素。腹膜乳斑为腹膜相关淋巴组织，是腹腔内不成熟的巨噬细胞起源部位。在腹膜转移过程中，腹腔游离癌细胞优先定植在乳斑内部，乳斑的独特解剖结构和血管分布为肿瘤细胞提供了提供了适宜的缺氧微环境。我们推测，在胃癌腹膜转移过程中，乳斑可以通过非特异性细胞毒作用部分清除成熟/衰老的胃癌细胞却不能清除胃癌干/祖细胞;在乳斑缺氧微环境下，胃癌干/祖细胞维持了未分化表型并且拥有很强的抗凋亡的能力，这亦有助于解释胃癌干/祖细胞在传统腹腔化疗后可以生存并且迅速再生成肿瘤，进而导致腹膜转移。另一方面，乳斑中的巨噬细胞可被肿瘤细胞重塑，形成旁路激活表型的肿瘤相关巨噬细胞，这亦有助于维持胃癌干/祖细胞的未分化表型。　　目的：　　确定肿瘤干细胞在转移灶中所在位置并了解其调控机制是成功治疗恶性肿瘤的一个重要的先决条件。现已证实，缺氧微环境可以通过触发胃癌干/祖细胞的适应性转录反应，调节肿瘤干细胞的分化和自我更新能力，并最终促使其向具有更强侵袭能力肿瘤表型发展。然而，我们仍然需要直接的证据来证明胃癌干/祖细胞优先定植在缺氧的乳斑中，同时缺氧微环境和HIF调控在维持胃癌干/祖细胞未分化表型过程中的作用机制亦需要进一步阐明。本实验以腹膜乳斑是胃癌细胞入侵腹膜的门户这一临床现象为切入点，以乳斑缺氧微环境对胃癌干/祖细胞生物学行为的调控为核心研究内容，以新的视角解释胃癌腹膜转移的成因，以期能够完善胃癌腹膜转移的分子机制，为有效防治胃癌腹膜转移提供新的思路与靶点，亦为腹腔其它脏器恶性肿瘤腹膜转移的防治提供依据。　　方法：　　1、采用免疫组化法检测HIF-1α、OCT4、Nestin在175例进展期胃癌中的表达情况，利用卡方检验分析HIF-1α的表达与胃癌临床病理特点的关系;采用K-M法及Logrank检验分析HIF-1α的表达与胃癌患者预后的关系;利用Kendall及Spearman非参数检验分析HIF-1α与OCT4和HIF-1α的表达水平的相关性。　　2、在体外诱导7例从胃癌腹膜转移灶中原代培养的胃癌细胞株缺氧，利用Western Blot方法检测缺氧对胃癌细胞中HIF-1α表达的影响;利用Transwell方法检验HIF-1α表达对胃癌细胞侵袭能力的影响;利用Western Blot方法检测HIF-1α表达对胃癌细胞EMT状态的影响;利用流式细胞术检测缺氧对胃癌细胞表面干细胞标志物表达的影响;利用流式细胞术检测缺氧对胃癌细胞侧群细胞亚群比率的影响。　　3、分选出胃癌细胞侧群细胞亚群，利用克隆形成和肿瘤球形成实验检测缺氧对胃癌细胞自我更新能力的影响;在第三代肿瘤球中利用免疫荧光共聚焦技术检测干细胞相关标志物OCT4及Nestin的表达;利用免疫荧光共聚焦技术检测胃癌干/祖细胞分化相关标志物Mucin5ac及Mucin6的表达。　　4、在裸鼠腹膜转移模型中，利用免疫荧光共聚焦技术动态检测胃癌干/祖细胞进入乳斑的病理过程;利用免疫荧光共聚焦技术动态检测胃癌干/祖细胞与乳斑缺氧区域的位置关系;利用免疫荧光共聚焦技术动态检测胃癌干/祖细胞中OCT4及Nestin与乳斑缺氧区域的位置关系。　　5、动物实验中，在正常裸鼠或乳斑巨噬细胞衰竭裸鼠中腹腔注射正常或干扰HIF-1α表达的胃癌细胞，通过检测裸鼠腹腔成瘤率、成瘤个数、腹水形成率以及形成腹水量体内考察破坏乳斑缺氧区域或者阻断乳斑内缺氧信号传递情况下，对腹膜转移的阻遏作用。　　6、建立持续性缺氧和间断性缺氧两组胃癌细胞体外缺氧模型，利用Western Blot方法检测不同缺氧模型对胃癌细胞中HIF-1α表达的影响;利用Real-time方法检测不同缺氧模型对胃癌细胞中缺氧相关基因表达的影响。　　7、利用划痕实验、Transwell等方法检测不同缺氧模型对胃癌细胞侵袭能力的影响;利用Western Blot、免疫荧光共聚焦方法检测不同缺氧模型对胃癌细胞EMT状态的影响。　　8、分选出胃癌细胞侧群细胞亚群，利用克隆形成和肿瘤球形成实验检测不同缺氧模型对胃癌细胞自我更新能力的影响;在第三代肿瘤球中利用免疫荧光共聚焦技术检测干细胞相关标志物OCT4及Nestin的表达。　　结果：　　1、胃癌患者HIF-1α的表达与干细胞标志物、转移方式及预后密切相关　　(1)HIF-1α的表达情况与组织分型、Lauren分型及复发情况密切相关。在组织分型中，HIF-1α表达阳性病例中未分化胃癌占77％，高于阴性表达病例的59.6％(P＜0.05)。在Lauren分型中，HIF-1α表达阳性病例中弥散型胃癌居多占62.3％，阴性表达的病例中肠型胃癌居多占53.5％(P＜0.05)。复发情况中，HIF-1α表达阳性病例中腹膜转移病例占34.4％，显著高于表达阴性病例中复发的比率16.7％(P＜0.05)。　　(2)OCT4表达阳性116例(65.2％)，阴性62例(34.8％);NESTIN表达阳性113例(63.5％)阴性65例(36.5％)。相关性分析显示，在Kendall检验中，HIF-1α表达情况与NESTIN表达情况呈显著正相关，相关系数为0.6(P＜0.05);与OCT3/4表达情况呈正相关，相关系数为0.44(P＜0.05)。在Spearman检验中，HIF-1α表达情况与NESTIN表达情况呈显著正相关，相关系数为0.71(P＜0.05);与OCT4表达情况呈正相关，相关系数为0.52(P＜0.05)　　(3)HIF-1α表达不同的病例行K-M生存分析，结果显示HIF-1α阴性表达病例预后好于阳性表达病例（图5），Log-Rank检验P＜0.05。　　2、缺氧通过上调HIF-1α表达诱导胃癌细胞EMT并增加干细胞比率　　(1)缺氧培养条件下，缺氧敏感的胃癌腹膜转移株GC1和GC2明显上调HIF-1α的表达。GC1和GC2转染慢病毒载体的HIF-1αshRNA，生物学行为稳定后缺氧培养24小时，GC1HIF-1α△和GC2HIF-1α△在缺氧条件下均未上调HIF-1α表达。　　(2)GC1和GC2细胞在缺氧条件下迁移能力显著强于常氧条件(2.8-and 2.4-fold increases,respectively;both P＜0.05).相反，GC1HIF-1α△ and GC2HIF-1α△细胞在常氧及缺氧条件下的迁移能力无显著变化。　　(3)缺氧条件下GC1和GC2细胞下调上皮细胞标志物E-cad的表达;上调间质细胞标记物α-SMA，GC1和GC2细胞发生了显著的EMT转化。而在GC1HIF-1α△和GC2HIF-1α△细胞中，α-SMA和E-cad的表达无明显变化。　　(4)缺氧培养条件下，GC1和GC2细胞CD44及Lgr5的表达显著高于常氧培养(8.7-and 5.1-fold increases for lgr5,both P＜0.05;1.7-and 7.1-fold increases for CD44，P=0.24 and P＜0.05，respectively).而在GC1HIF-1α△和GC2HIF-1α△细胞中，CD44或Lgr5的表达无明显变化。　　(5)在常氧条件下，GC1和GC1HIF-1α△均富含verapamil敏感的侧群细胞(6.4％ and 3.5％，respectively)。经过七天的缺氧培养，GC1细胞的SP亚群显著增加(for GC1,SP ratio was 6.4±0.54％ in normoxia and 22.46±3.57％ in hypoxia,P＜0.05)。而对于GC2和GC2HIF-1α△细胞，虽然表达高水平的干细胞标志物CD44和Lgr5，但是他们并不富含verapamil敏感的侧群细胞(both＜0.5％，data not shown)。　　3、缺氧增强胃癌干细胞样细胞自我更新能力，抑制多向分化能力　　(1)在缺氧条件下GC1sp细胞的克隆形成能力显著增强(31±3.6vs.13.7±2.1，P＜0.05)。然而GC1HIF-1α△细胞的SP亚群在常氧或缺氧条件下克隆形成能力无明显变化（5.3±0.5vs.5.1±2.1）。　　(2)GC1细胞SP亚群可以在缺氧条件下连续三代形成肿瘤球，并且肿瘤球形成率逐渐增加。GC1细胞SP亚群可以在常氧条件下肿瘤球形成能力并无明显变化。GC1HIF-1α△细胞的SP亚群在常氧或缺氧条件下肿瘤球形成能力亦无明显变化。　　(3)缺氧培养的GC1细胞SP亚群第三代肿瘤球中，HIF-1α的表达显著高于其他三组，各组肿瘤球中均存在HIF-1α高表达亚群，缺氧培养的GC1细胞的SP亚群第三代肿瘤球中该亚群细胞比率显著高于其他各组。OCT3/4表达定位于细胞核，缺氧培养的GC1细胞SP亚群第三代肿瘤球中其表达显著高于其他三组，且与HIF-1α存在共定位关系;Nestin表达定位于细胞膜，缺氧培养的GC1细胞SP亚群第三代肿瘤球中其表达显著高于其他三组，与HIF-1α存在共定位关系;GC1细胞的SP亚群第三代肿瘤球中，存在另外一群高表达OCT3/4但低表达HIF-1α的亚群，其他三组未发现该群细胞。　　(4)缺氧培养的GC1细胞SP亚群第三代肿瘤球中，HIF-1α的表达显著高于其他三组。Mucin5ac及Mucin6表达定位于细胞质，缺氧培养的GC1细胞的SP亚群第三代肿瘤球中的表达显著低于其他三组，与HIF-1α不存在共定位关系，高表达HIF-1α的细胞不表达Mucin5ac及Mucin6，三组中均存在另外一群高表达Mucin5ac及Mucin6但低表达HIF-1α的亚群。　　4、胃癌腹膜转移过程中乳斑呈现缺氧微环境　　(1)胃癌干细胞样细胞进入腹膜乳斑一周后，开始克隆性增生，乳斑边界模糊不清但尚可分辨;2周后，胃癌干细胞样细胞占据乳斑原有位置，进入快速增值阶段，周围大量巨噬细胞浸润，乳斑原有结构遭到破坏;乳斑内部胃癌干细胞样细胞的增殖速率远高于非乳斑区域的胃癌干细胞样细胞。　　(2)缺氧区域主要集中在乳斑密集的部位，而且呈带状环形包绕着乳斑，胃癌干细胞样细胞主要定植在乳斑带状缺氧区域的内部及边缘，与缺氧区域有较多重合;乳斑巨噬细胞则主要位于带状缺氧区域的边缘，与缺氧区域重合不多。　　(3)在缺氧区域中，胃癌干细胞样细胞高表达干细胞标志物OCT4和Nestin;在非缺氧区域，胃癌干细胞样细胞几乎不表达干细胞标志物OCT4和Nesfin。　　5、破坏乳斑缺氧微环境可以抑制胃癌干细胞样细胞的腹膜转移　　(1)经过9天（共三次）的clodronate liposomes作用后，裸鼠乳斑面积显著减小，单个乳斑内巨噬细胞数量亦显著减少。　　(2)正常裸鼠注射GC1细胞的SP亚群后腹膜转移情况最严重;乳斑巨噬细胞耗竭裸鼠注射GC1HIF-1α△细胞的SP亚群后腹膜转移情况最轻微。注射GC1HIF-1α△细胞的SP亚群的乳斑巨噬细胞耗竭裸鼠比注射GC1细胞的SP亚群的乳斑巨噬细胞耗竭裸鼠腹膜转移情况显著减轻;注射GC1HIF-1α△细胞的SP亚群的正常竭裸鼠比注射GC1细胞的SP亚群的正常裸鼠腹膜转移情况亦显著减轻。　　6、不同缺氧模型对SGC-7901细胞缺氧及缺氧相关蛋白/基因表达的影响　　(1)缺氧48小时后，HIF-1α开始表达于持续缺氧和间断缺氧的SGC-7901细胞，间断缺氧的SGC-7901细胞HIF-1α的表达高于持续缺氧的SGC-7901细胞;HIF-1α的表达在168小时后达到最大值。间断缺氧的SGC-7901细胞HIF-1α的表达多位于细胞核内及核周;持续缺氧的SGC-7901细胞HIF-1α的表达多位于胞浆。　　(2)在两组胃癌细胞缺氧模型中，缺氧相关基因HIF-1α、CA9、GLUT-1以及干细胞相关基因OCT4、Nanog的表达均显著上调(allP＜0.05);HIF-1α、CA9、Nanog基因在持续缺氧和间断性缺氧两组模型之间的表达无显著性差异(allP＞0.05);间断性缺氧模型中GLUT-1、OCT4的表达显著高于持续性缺氧模型(bothP＜0.05)。　　7、不同缺氧模型对SGC-7901细胞迁移，侵袭能力的影响　　(1)在两组胃癌细胞缺氧模型中，SGC-7901细胞的迁移能力均显著增强(1.7 and 1.9 times as large，respectively;both P＜0.05);两组胃癌细胞缺氧模型间SGC-7901细胞的迁移能力相比无统计学差异(P＞0.05)在两组胃癌细胞缺氧模型中，SGC-7901细胞的迁移能力均显著增强(2.0 and 3.3 folds，respectively，P＜0.05);间断性缺氧的SGC-7901细胞侵袭能力强于持续性缺氧的SGC-7901细胞(1.6-fold increase，P＜0.05)。　　(2)在两组胃癌细胞缺氧模型中，SGC-7901细胞上调上皮细胞特异性标志物E-cadherin蛋白的表达;下调间质细胞特异性标志物α-SMA蛋白的表达。在两组胃癌细胞缺氧模型中，SGC-7901细胞上调上皮细胞特异性标志物E-cadherin的表达;下调间质细胞特异性标志物α-SMA蛋白的表达。　　8、不同缺氧模型对SGC-7901细胞干细胞特性的影响　　(1)在两组胃癌细胞缺氧模型中，缺氧胃癌干细胞样细胞的克隆形成能力均显著增强(37±6.9 and 35±6.2 vs.13.7±2.7，respectively;both P＜0.05);间断性缺氧模型中胃癌干细胞样细胞的侵袭能力显著强于持续性缺氧中胃癌干细胞样细胞的侵袭能力(1.6-fold increase，P＜0.05)。缺氧SGC-7901的侧群细胞亚群均显著增加(20.8±2.2％ vs.14.7±1.5％ and 3.5±0.3％，respectively;both P＜0.05);间断性缺氧模型中SGC-7901细胞侧群细胞亚群显著高于持续性缺氧SGC-7901细胞侧群细胞亚群(1.4-fold increase，P＜0.05)。　　(2)缺氧培养肿瘤球中，HIF-1α的表达显著高于正常培养的肿瘤球。OCT4表达定位于细胞核，缺氧培养的肿瘤球中其表达显著高于正常培养的肿瘤球，且与HIF-1α存在共定位关系;Nestin表达定位于细胞膜，缺氧培养的肿瘤球中其表达显著高于正常培养的肿瘤球，且与HIF-1α存在共定位关系。　　结论：　　1、HIF-1α广泛表达于胃癌原发灶及转移灶中，对胃癌生物学行为产生重要影响。　　2、HIF-1α阳性表达是影响胃癌预后的独立危险因素。　　3、HIF-1α阳性表达与某些肿瘤干细胞标志物OCT4及Nestin的表达呈正相关，参与了缺氧微环境对胃癌干细胞样细胞生物学行为的调控。　　4、缺氧微环境下HIF-1α调控胃癌干细胞样细胞，增强其自我更新能力，减弱其多向分化能力。　　5、腹膜乳斑是适合胃癌干细胞样细胞定植的理想干细胞龛，其内部缺氧微环境调控胃癌干细胞样细胞使其维持未分化状态，处于休眠状态。　　6、破坏乳斑缺氧微环境或者破坏乳斑内缺氧信号传递可以减轻裸鼠腹膜转移的程度。　　7、胃癌间断性和持续性缺氧模型均可以诱导胃癌细胞缺氧，增强其侵袭转移能力，增加胃癌细胞群体中干细胞样细胞比率。　　8、间断性缺氧是比持续性缺氧更有效的缺氧刺激。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 腹膜乳斑缺氧维持胃癌干细胞样细胞自我更新能力促进腹膜转移的机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 不同缺氧模型对胃癌细胞SGC-7901转移潜能的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 缺氧诱导分子(HIFs)对肿瘤干细胞自我更新及分化的调控作用

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