特异性siRNA干扰XIAP基因对卵巢癌SKOV-3细胞影响的研究

摘要

本研究利用RNAi技术研究XIAP基因封闭后卵巢癌细胞增殖及凋亡的变化及对顺铂化疗敏感性的变化，以逐步增加对其在卵巢癌发生、发展中作用的认识，并籍此探讨卵巢癌基因治疗的方法和途径。全文共分三部分： 第一部分，卵巢上皮癌中XIAP及Caspase-3的表达及意义。 研究目的：检测XIAP及caspase-3在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达，分析二者间的相关性及与卵巢肿瘤细胞凋亡的关系，从而探讨XIAP、caspase-3与卵巢上皮癌发生、发展的关系。 第二部分，RNA干扰XIAP基因对卵巢癌细胞SKOV-3增殖及凋亡的影响。 研究目的：合成XIAP特异性的siRNA，瞬时转染卵巢癌细胞SKOV-3，观察XIAPmRNA和蛋白的变化及对细胞增殖及凋亡的的影响。 第三部分，XIAP siRNA对卵巢癌细胞化疗敏感性影响的实验研究。 研究目的：研究特异性siRNA转染卵巢癌细胞SKOV-3，XIAP基因封闭后，对顺铂化疗敏感性的影响。 研究方法： 第一部分：利用免疫组化(SP)法和TdT介导的dUTP的缺口末端标记(TUNEL)技术，检测15例正常卵巢组织、20例卵巢良性上皮性肿瘤和52例卵巢恶性上皮性肿瘤组织中XAIP和caspase-3蛋白的表达及细胞凋亡情况，并分析其与各种临床病理参数的关系及三者间的相关性。 第二部分：建立T7体外转录体系，合成特异性siRNA，用脂质体瞬时转染法介导XIAPsiRNA处理卵巢癌细胞SKOV-3后，RT-PCR检测转染后XIAP mRNA的变化，western blot检测XIAP蛋白的变化，MTT法检测细胞的相对存活率，TUNEL法及流式细胞仪检测细胞凋亡。 第三部分：建立T7体外转录体系，合成特异性siRNA，用脂质体瞬时转染法介导XIAPsiRNA处理卵巢癌细胞SKOV-3，再将细胞暴露于不同剂量顺铂，MTT法检测细胞的相对存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡。 研究结果： 第一部分： XIAP在正常组织中阳性率为26.7％，在良性卵巢肿瘤组织中阳性率为35％，在恶性卵巢肿瘤组织中阳性率为73.1％，三组之间差异有统计学意义，x<'2>=14.992，(P<0.01)。XIAP在卵巢恶性肿瘤中的表达明显高于其在正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织中的表达。Casapase-3在卵巢恶性肿瘤中的表达明显高于其在正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织中的表达。在卵巢上皮癌组织中，XIAP的表达与caspase-3的表达及细胞凋亡指数(AI)呈负相关，caspase-3的表达与细胞凋亡指数(AI)呈正相关。卵巢上皮癌中XIAP表达与各临床病理因素无关，但随着细胞分化程度的降低，XIAP表达出现逐渐增高的趋势。 第二部分： 特异性XIAP siRNA转染后，细胞形态变圆、折光性增强、收缩不铺展，凋亡数增多。采用RT-PCR检测各组XIAPmRNA表达显示，XIAP-mRNA的表达明显下降，并呈剂量依赖性。计数各组在转染后24h、48h、72h和96h的活细胞数显示，特异性干涉组的细胞数分别为对照组的82.71％、54.20％、60.03％、49.64％；在48h、72h和96h时间点各组活细胞数比较，特异性干涉组与其它组间的差异均有统计学意义(P<0.01)，非特异性干涉组与空白对照组相比差异无统计学意义。MTT法检测各组细胞的吸光度值，特异性干涉组与非特异性干涉及空白对照组比较，在48h、72h和96h时间点差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪分析XIAPsiRNA对各组细胞在干涉后各时间点的凋亡的影响显示，特异性干涉组细胞随XIAPmRNA表达下降，细胞凋亡率逐渐增加，到干涉后第六天凋亡率达最高水平，与非特异性干涉组、空白对照组比较差异显著，非特异性干涉组与空白对照组比较没有明显差异。TLJNEL检测显示，特异性干涉组大量细胞出现细胞核固缩、浓聚成致密的斑点状，大小不一，形成凋亡小体等细胞凋亡的特征性改变。空白组及非特异性干涉组仅见极少的凋亡细胞，特异性干涉组凋亡指数比非特异性干涉组及空白对照组明显增高，差异显著。 第三部分： 暴露于顺铂后，细胞存活率随顺铂浓度的增加而降低，其中，转染XIAPsiRNA组细胞减低最为显著。在给予1μg/ml顺铂后，转染XIAP siRNA组的存活率(58.23％)与转染非特异性siRNA组(65.38％)、空白对照组(68.56％)相比，有显著的差异(F=6.758，P<0.05)，而非特异性组与空白对照组之间没有明显的差异(P>0.05)。暴露于顺铂的各组与单独转染特异性siRNA组比较，细胞存活率明显降低(P<0.05)。在给予1μg/ml顺铂后，采用Annexin-V的方法检测不同时间(2d、3d、4d)细胞凋亡率的变化情况，结果显示：联合用药组细胞的凋亡率明显增加，在各时间点与单独使用顺铂及单独使用XIAPsiRNA组相比，差异显著。 研究结论： 第一部分： XIAP在卵巢上皮癌的发生过程中起重要作用，其机制可能为抑制细胞中caspase．3的表达，从而抑制细胞凋亡。XIAP有可能成为治疗卵巢癌的靶标之一。 第二部分： 特异性siRNA可抑制SKOV-3细胞XIAPmRNA及蛋白的表达，并明显地抑制SKOV-3细胞的生长活性、促进SKOV-3细胞凋亡，其抑制细胞生长、促进细胞凋亡作用可能与其抑制细胞XIAP mRNA及蛋白的表达有关。 第三部分： 特异性siRNA可以诱导卵巢癌细胞凋亡、抑制细胞增殖并增强顺铂的化疗敏感性。

目录

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中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

第一部分卵巢上皮癌中XIAP及Caspase-3的表达及意义

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分RNA干扰XIAP基因对卵巢癌细胞SKOV-3增殖及凋亡的影响

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第三部分XIAPsiRNA对卵巢癌细胞化疗敏感性影响的实验研究

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 凋亡抑制蛋白IAP与肿瘤

本研究独创性自我评价

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