药用植物凤丹(Paeonia suffruticosa)根际土壤细菌群落特征的研究

摘要

凤丹（Paeonia suffruticosa Andr.）为芍药科多年生植物，是一种重要的传统中药资源。在其生长发育的周期中与土壤微生物尤其是根际土壤微生物有密切的关系。本文通过构建16S rRNA基因克隆文库及文库的限制性片段长度多态性分析（ARDRA)，对中国药用植物凤丹（P. suffruticosa）5大主要分布区域的根际土壤细菌群落多样性进行了研究。采用限制性内切酶HinfI和Csp6I对克隆文库中的1000个克隆子进行了酶切分型，根据酶切图谱的不同，可将其分为324个OTUs，并挑选相应的代表克隆子进行了测序和系统发育分析。16S rRNA基因序列分析结果表明，凤丹主要产区根际土壤细菌种群主要包括α-,β-,γ-和δ-Proteobacteria，Acidobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes，Verrucomicrobia，Gemmatimonadetes，Chloroflexi，TM7，Nitrospirae，Firmicutes和Planctomycetes的14个类群，此外还有部分未归类细菌。其中Proteobacteria(α,γ,βandδ)为优势菌群，其次是Acidobacteria和 Actinobacteria。Pseudomonas sp.、Burkholderia sp.和Arthrobacter sp.为优势菌属。通过PCR-DGGE法对丫山不同生长年限、不同生长时期凤丹根际土壤细菌群落结构变化规律进行研究，结果表明种植凤丹的根际土壤细菌群落多样性低于荒地，随着种植年限的增长，细菌群落组成趋于稳定；丫山凤丹根际土壤环境因子越相似，根际细菌群落结构也越相似。
　　通过对凤丹主要产区根际土壤和丫山不同生长年限、不同生长时期凤丹根际土壤细菌群落特征的研究，结果表明凤丹根际土壤细菌种群不仅具有丰富的多样性,还存在丰富的潜在新菌种，凤丹根际土壤细菌群落组成间没有明显的差异性。

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第一章 绪 论

1.1 植物根际细菌研究

1.1.1 植物根际和根际细菌概念

1.1.2 根际细菌的生物多样性

1.1.3 根际细菌的功能多样性

1.2 影响根际细菌多样性的各种因素

1.2.1 土壤自身因素

1.2.2 在土壤中生长的植物类型

1.2.3 不同的土壤管理方式

1.2.4 重金属与化学制剂污染

1.2.5 季节的变化给土壤微生物的影响

1.3 植物根际细菌的研究方法

1.3.1 传统的分离培养（Culture-dependent）方法

1.3.2 酶动力学方法（BIOLOG微量分析）

1.3.3 生物化学方法（PLFA图谱分析）

1.3.4 杂交技术方法（荧光原位杂交）

1.3.5 基于PCR的分子生物学方法

1.4 凤丹研究现状

1.4.1 凤丹资源及药用品质研究

1.4.2 凤丹的生长发育研究

1.4.3 凤丹的土壤微生物研究

1.5 本研究目的和意义

第二章 凤丹主要产区根际土壤细菌群落特征的研究

2.1 材料与方法

2.1.1 研究区域概况

2.1.2 试剂及仪器设备

2.1.3 土壤采集方法

2.1.4 土壤样品理化性质的测定

2.1.5 土壤微生物总DNA提取

2.1.6 凤丹根际土壤细菌群落16S rRNA基因克隆文库的构建

2.1.7 ARDRA分型

2.1.8 克隆文库评价

2.1.9 序列测定和系统发育分析

2.1.10 核酸序列提交

2.2 结果与分析

2.2.1 土壤理化性质

2.2.2 16S rRNA基因克隆文库的构建及检测

2.2.3 16S rRNA基因克隆文库的 ARDRA 分型

2.2.4 克隆文库的评价

2.2.5 核酸序列检索号

2.2.6 凤丹根际细菌群落特征

2.2.7 克隆文库间差异分析

2.3 讨论

第三章 丫山不同生长年限、不同生长时期凤丹根际土壤细菌群落特征的研究

3.1 材料与方法

3.1.1 试剂及仪器设备

3.1.2 土壤采集方法

3.1.3 土壤样品理化性质的测定

3.1.4 土壤微生物总DNA提取及16S rRNA 基因全长扩增

3.1.5 16S rRNA基因V3区的扩增

3.1.6 变性梯度凝胶电泳DGGE

3.1.7 染色

3.1.8 DGGE条带切胶回收

3.1.9 DGGE 分离的DNA片段扩增及纯化

3.1.10 16S rRNA V3区基因片段克隆及阳性克隆序列测定

3.2 数据分析

3.2.1 DGGE图谱相关统计分析

3.2.2 DGGE条带的序列测定和系统进化分析

3.2.3 CANOCO 典型分析（RDA）

3.3 结果与分析

3.3.1 土壤理化性质

3.3.2 16S rRNA基因V3区PCR扩增

3.3.3 DGGE图谱相关分析

3.3.4 DGGE条带的序列和系统进化分析

3.3.5 丫山凤丹根际土壤中细菌分布与环境因子的相关性分析（RDA分析）

3.4 讨论

第四章 结 论

参考文献

致谢

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文