关于透明质酸钠在体外降解速率的研究及临床意义

摘要

目的：　　透明质酸是天然存在于人体内的一种粘多糖，由β-D-葡萄糖醛酸(GlcA)和β-N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)两种单糖以交替的β-(1→4)和β-(1→3)糖苷键连接形成。存在于皮肤中的透明质酸分子与水分子形成极性键和氢键，结合大量水，具有较好的保湿效果，被冠以“天然保湿因子(NMF)”之名。天然透明质酸在组织中易扩散，且易被人体内的氧化物质或酶降解，清除速度很快，限制了其临床应用。为了克服这一缺点并提高粘弹性，市场上常使用交联剂对天然透明质酸进行化学修饰，得到交联透明质酸钠凝胶，其中1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)是大多数市场领先的透明质酸钠填充剂中使用的交联剂。由于其特殊的理化性质，透明质酸钠目前在医学美容领域应用广泛，尤其用于软组织填充效果显著。但随着透明质酸钠注射数量的增加，注射后并发症数量也在同时增加，一旦发生，轻则影响美观，重则危及生命。透明质酸酶可催化降解透明质酸，形成葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺两种单糖，常被临床医生选择用于治疗透明质酸钠注射后并发症。本实验的研究目的，就是通过观察体外透明质酸酶溶解透明质酸钠时，一定时间内降解过程的若干个时间点上透明质酸钠的溶解率，了解透明质酸钠降解的体外动力学特性，协助临床医生对透明质酸钠注射并发症的治疗。　　方法：　　本实验分为两部分：透明质酸钠体外降解和葡萄糖醛酸检测。实验分组为2、4、8、12、16、24小时酶解组，和24小时不含酶组，每组3份。透明质酸钠降解实验使用磷酸盐缓冲液(PBS)将透明质酸钠凝胶稀释到透明质酸钠浓度为4mg/g的溶液，并配制浓度为2U/ml的透明质酸酶试剂。降解当日取33.333g透明质酸钠溶液，加入66.666g透明质酸酶试剂进行反应，酶解组反应时间分别为2、4、8、12、16、24小时。24小时不含酶反应组，除不加入透明质酸酶，其余步骤与24小时反应组的操作步骤完全相同。反应结束后用0.45μm过滤器进行过滤，然后按照过滤后溶液重量与调整后溶液重量之比为0.666的比例对过滤后溶液进行调整，完成后冷藏备用。　　葡萄糖醛酸检测实验包括测试溶液和标准溶液的制备、咔唑反应、紫外分析。取体外降解反应中每组酶解反应调整后溶液0.666g，加0.400g浓度为1mol/L的盐酸溶液稀释，并加水得到稀释倍数F=8的测试溶液。取24小时不含酶组调整后溶液2.000g，加0.400g浓度为1mol/L的盐酸溶液稀释，并加水得到稀释倍数F=3的测试溶液。制备浓度为1000μg/g的葡萄糖醛酸溶液原液，稀释得到浓度为200μg/g的中间液，再将中间液用水稀释后制备浓度为80/60/40/20/12μg/g的葡糖醛酸标准液T5/T4/T3/T2/T1。咔唑反应试剂由试剂A和试剂B组成，将3.133g纯五水四硼酸钠溶解于458.000g浓度为0.033mol/L的纯硫酸中得到试剂A，将0.1254g纯咔唑溶于78.900g浓度为0.0075mol/L的纯乙醇中得到试剂B。将每组稀释后测试溶液和标准溶液分别进行3次咔唑反应，反应完成后进行紫外分析，检测各组溶液在波长为530nm处的吸光率。　　通过标准溶液的吸光率制作标准曲线，利用测得的测试溶液吸光率，从标准曲线上查出相应的葡萄糖醛酸浓度，可计算出测试溶液中透明质酸钠浓度。每组溶液取透明质酸钠浓度的平均值计算出测试溶液中透明质酸钠重量，该重量与最初重量之比即为透明质酸钠的降解率。　　结果：　　在37℃，透明质酸酶浓度为2U/ml的体外实验中，33.333g浓度为4mg/g的稀释后透明质酸钠在反应时间为2、4、8、12、16、24小时的各组反应中分别约有5.87mg、25.03mg、68.81mg、100.88mg、116.28mg和130.67mg透明质酸钠发生完全降解，平均降解率分别为4％、19％、52％、76％、87％、98％;在不含透明质酸酶的情况下，暴露于空气中的33.333g浓度为4mg/g的稀释后透明质酸钠溶液24小时约有6.35mg发生完全降解，降解率为5％。　　结论：　　透明质酸酶降解透明质酸钠作用高效且专一性强，降解率随时间延长而增大，在24小时内几乎完全降解，适用于临床上透明质酸钠注射填充后发生不良后果时的治疗。

目录

声明

摘要

前言

透明质酸钠体外降解反应

一、实验试剂和仪器

二、实验方法

三、实验结果

葡萄糖醛酸检测

一、硫酸咔唑法的基本原理

二、实验试剂和仪器

三、实验方法

四、实验结果

讨论

结论

参考文献

综述

致谢