三维灌注系统富集人脑胶质瘤干细胞培养方法的探索

摘要

背景与目的：自2003年加拿大学者singh首先从人脑胶质瘤手术标本中克隆、并鉴定了人脑胶质瘤干细胞(GSC)以来，人们对GSC的认识在争论中往前推进，经过10多年的努力，对GSC功能的认识仍然不够深入，特别是GSC在肿瘤细胞群中与其它分化细胞的关系不很明确，就GSC定义而言，它是少数具有自我更新能力并能够产生异质性肿瘤细胞的细胞，并且随着GSC数量的增加而恶性程度增高，预后变差。但就体外培养的GSC而言，数量的多少除了与培养基成份有关，还与其生长的空间结构不无关系。本文旨在探索三维培养的GSC与传统二维培养的GSC相比，能否达到富集GSC生长的目的。　　材料与方法：人脑胶质瘤干细胞GSC23由美国德克萨斯州大学M.D.Anderson肿瘤中心赠送。3D聚已内酯支架（3D Cell Scaffold PCL）购于天津卫凯生物工程有限公司。三维灌流培养系统Tissueflex?由英国Zyoxel公司提供。干细胞培养基购自美国Gibco公司。干细胞标志蛋白CD133购于英国Abcam公司。将GSC23（1×105）分别接种于普通平板、PCL支架和带有PCL支架的三维灌流培养体系中。在三种不同培养条件下，分别进行荧光倒置显微镜下观察细胞生长状况以及细胞形态空间结构变化，用Alamar Blue方法测定细胞生长曲线，用免疫细胞化学荧光染色方法检测CD133+细胞的比例。用SPSS18.0统计软件进行统计分析。　　结果与分析：相比于普通平板培养条件，在PCL支架和灌流条件下细胞形态能维持在悬浮培养条件时的成球状态，且它们的增殖速度更快。普通平板组CD133+细胞比例低（17.56±2.39％），PCL支架组CD133+细胞比例高（33.50±6.62%），灌流组CD133+细胞比例更高（51.77±6.07%）。经SPSS18.0软件统计结果2D组和PCL支架组差异有统计学意义；PCL支架组和三维灌流培养组差异也有统计学意义。表明PCL支架创造的网格样空间结构，让定居在上面的GSC23细胞获得了一个有利于扩增、类似于实体瘤的三维空间，如果在这个空间环境里再有类似于血液，即流动着的干细胞培养液，滋养着GSC23细胞生长，则就能达到最大程度富集胶质瘤干细胞的目的，三维灌流培养系统能做到这一点。　　结论：用传统方法在普通培养皿中培养，分化细胞都贴壁生长（二维），唯有为数极少的漂浮在培养液中（三维）、折光性很强的小圆细胞，实际上其中不乏干细胞，说明只有三维空间才有利于干细胞生长；当提供的是三维的PCL支架而不是二维的普通培养皿时，能够富集GSC23细胞生长的根本原就在于提供的是三维空间。一旦既在三维空间里，又能获得及时更新的培养液，更加符合GSC23扩增所需的“吐故纳新”条件时，GSC23细胞便会大量富集。