装载促血管再生基因的丝素支架构建及其对真皮再生的影响

摘要

促进微血管再生，加快血管化速度，对于提高皮肤真皮再生支架的存活率至关重要。本文将含有核定位短肽的鱼精蛋白(PS)偶联到富含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)三肽序列和组氨酸(His)的柞蚕丝素蛋白(ASF)上，构建同时具有细胞靶向性、内涵体逃逸及细胞核定位多功能的可生物降解新型阳离子化丝素(AP)。通过(AP+PEI)共包被和AP/ASF/PEI层层包被VEGF及Ang-1双基因共表达质粒将质粒pDNA负载到丝素支架上，得到装载促血管再生基因的丝素支架。利用(AP+PEI)共包被和AP/ASF/PEI层层包被基因载体传递促血管再生的VEGF165-Ang-1双基因共表达质粒原位转染细胞，促进被转染细胞持续、局部地分泌VEGF、Ang-1等血管再生所需的生长因子，加速支架的血管化速度，提高真皮再生支架的成活率。　　首先，在EDC介导下，使柞蚕丝素蛋白的羧基与鱼精蛋白的氨基发生偶联反应生成酰胺键，建立对柞蚕丝素进行阳离子化改性的技术。测试显示，当柞蚕丝素与鱼精蛋白质量比为100/10时，柞蚕丝素的Zeta电位从-5.2mV上升到+15.5mv，等电点pI从4.2变为8.7。当AP/pDNA质量比大于4/2时能将pDNA完全包裹，且复合物表面带正电荷。　　(AP+PEI)共包被法和AP/ASF/PEI层层包被法均能高效得包裹pDNA，并保护pDNA免受核酸酶的降解。(AP+PEI)/pDNA复合物表面Zeta电位为+20~+30mV，平均直径分布为200~400nm。AP/ASF/PEI/pDNA复合物表面Zeta电位分为+15~+25mV，平均直径分布为400~600nm。(AP+PEI)共包被法和AP/ASF/PEI层层包被法均能介导质粒pDNA成功转染EA.hy926细胞，并表现出较高的转染效率和较低的细胞毒性。AP/ASF/PEI层层包被法的转染效率略高于(AP+PEI)共包被法。　　采用冷冻干燥法将(AP+PEI)/pDNA((30+10)/2)和AP/ASF/PEI/pDNA(45/45/10/2)复合物装载到丝素支架中，制备基因活性丝素支架。复合物在支架内分散良好，细胞在该支架内部正常粘附和生长。(AP+PEI)/pDNA((30+10)/2)和AP/ASF/PEI/pDNA(45/45/10/2)复合物能成功将VEGF165-Ang-1双基因共表达质粒导入目的细胞，导入的基因能正常地表达并分泌VEGF，且随时间的延长VEGF分泌量显著增多。该基因活性丝素支架体外能转染鸡胚尿囊膜上的细胞，并刺激其生成丰富的血管，且血管形态呈多分支的弥漫放射状，血管数目及大小都明显高于未装载基因活性物质的丝素多孔材料组。　　进一步，将该丝素基因活性支架植入SD大鼠背部全层皮肤缺损创面，体内实验结果显示该支架炎症反应轻微，能良好地与周围组织融合。周围组织及真皮修复细胞迁入材料内部，支架可引导新生组织的长入和毛细血管形成，并促进表皮成活。随着修复时间的延长，支架内新生毛细血管和胶原纤维的生成量明显比单纯丝素多孔支架内多。在创面修复早期，该基因活性支架内VEGF、Ang-1、CD31、α-SMA、PDGF、bFGF和vWF因子的阳性表达率都比未装载基因的丝素多孔支架高，进一步说明装载(AP+PEI)/pDNA((30+10)/2)和AP/ASF/PEI/pDNA(45/45/10/2)基因活性物质的丝素支架，能够原位转染周围细胞并表达和分泌目的基因对应的VEGF和Ang-1因子，为组织修复细胞的迁移、粘附、生长及功能发挥创造良好的微环境，进而促进血管再生，进而促进真皮组织的修复重建。

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第一章 引 言

1.1 皮肤再生支架的血管化

1.2 真皮再生支架的促血管化策略

1.3 基因传递载体

1.4 柞蚕丝素作为新型基因传递载体的潜力

1.5 用鱼精蛋白改性柞蚕丝素的可行性

1.6 蚕丝丝素及其真皮再生支架

1.7 本文的研究目的和主要内容

第二章 鱼精蛋白对柞蚕丝素蛋白的阳离子化改性

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

2.3 本章小结

第三章 共包被(AP+PEI)/pDNA复合物的构建及其介导基因传递的体外研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与讨论

3.3 本章小结

第四章 层层包被的AP/ASF/PEI/pDNA复合物的构建及其介导基因传递的体外研究

4.1 材料与方法

4.2 结果与讨论

4.3 本章小结

第五章 装载VEGF及Ang-1双基因共表达质粒的丝素基因活性支架的及其体外转染

5.1 材料与方法

5.2 结果与讨论

5.3 本章小结

第六章 装载基因活性物质的丝素支架用于促血管化的体内实验研究

6.1 材料与方法

6.2 结果与讨论

6.3 本章小结

第七章 结 语

7.1 全文结论

7.2 本文的主要创新点

7.3 论文的不足及后续研究计划

参考文献

攻读学位期间本人发表论文情况

致谢