声明
摘要
第一章猪繁殖与呼吸综合征病毒基因功能及致病机制研究进展
1病毒基因及编码蛋白功能
1．1病毒粒子和基因组结构
1．2病毒蛋白功能
2病毒致病性及免疫特性
2．1病毒致病性
2．2病毒免疫特性
3病毒与宿主免疫应答
3．1病毒抑制宿主天然免疫应答
3．2病毒影响干扰素的产生
4病毒感染引起的炎性反应
4．3 PRRSV诱导的炎性反应
5 CD83分子概述
5．1 CD83的结构和生物学特性
5．2 CD83分型及生物学功能
6 PRRSV先天性免疫相关信号通路
6．2 Sp1信号通路
7树突细胞(Dendritic cells)生物学特性
8本研究的研究目的和意义
参考文献
第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导树突细胞CD83表达及关键功能蛋白的探寻
1材料与方法
1．1质粒与病毒
1．2仪器与试剂
1．3病毒增殖与滴度测定
1．4 PBMC分离与MoDCs制备
1．5流式细胞术检测CD86和CD83
1．6实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
1．7夹心ELISA检测sCD83蛋白
1．8 CD83启动子基因克隆鉴定
1．9 CD83启动子报告载体的构建
1．10去内毒素质粒提取
1．11双荧光报告基因Luciferase检测系统验证CD83启动子活性
1．12 PRRSV对pCD83的作用
1．13 PRRSV编码蛋白真核表达质粒的构建
1．14 Western blotting
1．15数据分析
2结果
2．1 MoDCs制备与鉴定
2．2 PRRSV感染对MoDCs分泌CD83蛋白水平的影响
2．3 PRRSV不同毒力毒株上调CD83的比较
2．4 PRRSV感染诱导CD83上调具有剂量依赖性
2．5 PRRSV诱导CD83上调具有时间依赖性
2．6猪CD83启动子的克隆和序列分析
2．7猪CD83启动子活性的鉴定
2．8 PRRSV编码蛋白真核表达质粒的构建与鉴定
2．9 PRRSV及其编码蛋白对猪CD83启动子活性的影响
3讨论
参考文献
第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制
1材料与方法
1．1质粒与试剂
1．2 N蛋白截断突变表达载体的构建
1．3质粒DNA提取
1．4 Western-blotting
1．5 PRRSV N基因突变毒株感染性cDNA克隆的构建及病毒拯救
1．6重组病毒RNA提取
1．7 cDNA合成
1．8实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
1．9 PRRSV空斑实验
1．10 PRRSV生长曲线的测定
1．11重组病毒对Marc-145中pCD83的作用
1．12重组病毒对MoDCs中CD83的作用
1．13 Sp1基因干扰RNA干扰试验
1．14信号通路抑制剂的干扰试验
1．15数据分析
2结果
2．1 PRRSV N蛋白对CD83启动子活性的上调作用
2．3 N蛋白突变体的构建及其对CD83启动子的作用
2．4 PRRSV感染性cDNA克隆突变体构建及重组病毒拯救
2．5 PRRSV N蛋白基因突变重组病毒对CD83启动子活性的影响
2．6 PRRSV突变病毒感染MoDCs后对CD83蛋白水平的影响
2．8 Sp1 siRNA抑制PRRSV N蛋白CD83启动子的上调
2．9 NF-κB抑制剂抑制PRRSVN蛋白对猪CD83启动子的激活
2．10 PRRSV能够诱导MoDCs中Sp1和NF-κB上调
2．12 PRRSV N蛋白突变体对Sp1及NF-κB mRNA水平的影响
2．14 PRRSV N蛋白突变体通过Sp1及NF-κB调节CD83启动子活性
3讨论
参考文献
第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp10诱导树突细胞CD83表达及其分子机制
1材料与方法
1．1质粒与试剂
1．2 Nsp10蛋白截断突变表达载体的构建
1．3质粒的提取
1．4 Western-blotting
1．5 PRRSV nsp10突变毒株感染性cDNA克隆构建
1．6 PRRSV nspl0突变毒株的拯救
1．7重组病毒RNA的提取
1．8 RT-PCR扩增各片段
1．9病毒空斑试验
1．10病毒生长曲线的测定
1．12重组病毒对MoDCs中CD83的作用
1．13数据分析
2结果
2．2 Nsp10突变体的构建及其对CD83启动子的作用
2．4 PRRSV nsp10突变毒株感染性cDNA克隆构建与病毒拯救
2．5 PRRSV nsp10突变病毒对CD83启动子活性的影响
2．6 PRRSV nsp10突变病毒感染MoDCs对CD83蛋白水平的影响
2．7 Sp1 siRNA抑制PRRSV nsp10蛋白CD83启动子的上调
2．8 NF-κB抑制剂抑制PRRSV nsp10蛋白对猪CD83启动子的激活
2．10 SP1干扰RNA和NF-κB抑制剂抑制Nsp10蛋白突变重组病毒激活CD83基因启动子活性
3讨论
参考文献
第五章猪繁殖与呼吸综合征病毒通过CD83介导抑制树突细胞免疫调节作用
1材料与方法
1．1菌株与质粒
1．2主要试剂
1．3 原核表达质粒pGEX-6P1-sCD83的构建
1．4刺激细胞(MoDCs)的制备
1．5反应细胞的制备
1．6混合淋巴细胞反应
1．7 sCD83蛋白对树突细胞培介导T细胞增殖的抑制实验
1．8 PRRSV对树突细胞培养介导T细胞增殖的抑制实验
1．9 western blotting
1．10 RT-PCR
1．11数据分析
2结果
2．1猪sCD83基因克隆、表达和鉴定
2．2 sCD83融合蛋白的纯化及其含量的测定
2．3 sCD83蛋白抗原性测定
2．4 sCD83作用的MoDCs对T细胞增殖的影响
2．5 sCD83对MoDCs抗原提呈相关蛋白的抑制效应
2．6 PRRSV对MoDCs介导的T细胞增殖抑制效应
2．7 PRRSV对MoDCs抗原提呈相关蛋白的抑制效应
2．8 PRRSV由CD83介导抑制MoDCs抗原提呈相关蛋白
3讨论
参考文献
第六章猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp1α诱导树突细胞CD83表达及关键氨基酸位点解析
1材料与方法
1．1质粒与试剂
1．2 Nsp1α蛋白截断突变表达载体的构建
1．3质粒的提取
1．4 Western-blotting
1．5利用BB0907毒株感染性cDNA克隆构建相应的突变体和回复体
1．6病毒拯救
1．7重组病毒RNA的提取
1．8 RT-PCR扩增各片段
1．9空斑试验
1．10生长曲线的测定
1．11重组病毒对Marc-145中pCD83的作用
1．12重组病毒对MoDCs中CD83的作用
1．13 T细胞的制备
1．14混合淋巴细胞反应
1．15 sCD83蛋白对树突细胞培介导T细胞增殖的抑制实验
1．16数据分析
2结果
2．1 Nsp1α激活CD83报告基因活性
2．2 Nsp1α截断体以及突变体的构建及其对CD83启动子的作用
2．3 PRRSV nsp1α突变重组病毒的构建与鉴定
2．4 PRRSV nsp1α突变病毒对CD83启动子活性的影响
2．5 PRRSV nsp1α突变病毒对树突细胞中CD83表达的影响
2．6 PRRSV nsp1α突变病毒对MoDCs介导的T细胞增殖的影响
2．7 PRRSV nsp1α突变病毒对MoDCs抗原提呈相关蛋白的影响
3讨论
参考文献
全文总结
主要创新点
致谢
南京农业大学;
