豌豆胆色素原脱氨酶新型表达载体构建与定点突变

摘要

所有卟啉类化合物生物合成共有途径由三个酶催化，它们分别是5-氨基酮戊酸脱水酶(ALAD)，胆色素原脱氨酶(ilinogendeaminase，PBGD)和尿卟啉原Ⅲ合酶。PBGD是共有途径的调控酶。为研究豌豆胆色素脱氨酶在大肠杆菌的高效表达，本实验构建了PBGD的T5启动子下的双标签表达载体pQE30PBGD和T7启动子下的双标签表达载体p28PBGD，双标签分别为组氨酸标签和抗链霉素蛋白短肽标签。为确定酶的保守氨基酸残基Ala188对酶活的贡献，本实验将Ala188突变成Ser188，测序验证。为防止PBGD催化的产物尿卟啉原Ⅰ毒害转化细胞，将枯草杆菌UROS的表达载体和p28PBGD共转化。为调控PBGD的表达，我们又将合成胆色素原(PBGD辅基成分)的5-氨基酮戊酸脱水酶的表达载体和p28PBGD共转化。分别诱导表达p28PBG/pA-ALAD和p28PBGD/pA-UROS，Ni-NTA亲和层析柱纯化。结果如下：1.构建了T5启动子下的pQE30sPBGD和T7启动子下的p28PBGD表达载体，表达重组豌豆胆色素脱氨酶，它的C-端含有8个氨基酸短肽的strep标签，N-端含有组氨酸标签。2.定点突变胆色素原脱氨酶保守氨基酸A188S。3.分别将胆色素原脱氨酶的上游和下游的两个酶5-氨基酮戊酸脱水酶和尿卟啉原Ⅲ合酶，插入pET-3a，再将酶切的含T7启动子和RBS序列的两个酶的基因序列插入pCYC184中。4.S分别诱导表达p28PBG/pA-ALADBL21(DE3)和p28PBGD/pA-UROSDS-PAGEBL21(DE3)，SDS-PAG电泳表明豌豆胆色素原脱氨酶纯化有一条主带，分子量约为44Kd。

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文献综述

1.血红素生物合成研究进展

2.卟啉生物合成共有酶类研究进展

2.1 5-氨基酮戊酸脱水酶(ALAD)

2.2胆色素原脱氨酶（Porphobilinogen deaminase,PBGD）

2.3尿卟啉原Ⅲ合酶(Uroporporphyrinogn Ⅲ synthase,UROS)

前言

1.植物胆色素原脱氨酶研究进展

2.实验的研究意义

3.实验的研究内容及技术路线

材料与方法

1试验材料

2仪器设备和试剂

3方法

3.1重组豌豆胆色素原脱氨酶表达载体的构建

3.2豌豆胆色素原脱氨酶定点突变

3.3共表达载体的构建

3.4重组豌豆胆色素脱氨酶的诱导表达

结果与分析

1豌豆胆色素原脱氨酶表达载体的构建

1.1双标签载体pQE30S的构建

1.2 PCR扩增胆色素原脱氨酶基因

1.3表达载体pQE30sPBGD的构建

1.4p28PBGD载体的构建

2豌豆胆色素原脱氨酶定点突变

3共表达载体的构建

3.15-氨基酮戊酸脱水酶表达载体pA-UROS的构建

3.2pA-ALAD构建

3.3共表达菌株的转化与筛选

4 PBGD的诱导表达与纯化

讨论

1豌豆胆色素脱氨酶共表达载体的构建

2共表达载体构建策略的探讨

3双标签表达载体的应用

3定点突变在胆色素原脱氨酶研究中的应用

结论

参考文献

致谢

作者简历

附录