Bt蛋白试剂盒的制备及抗虫棉Bt蛋白时空表达的研究

摘要

转Bt基因抗虫棉在我国应用最广，它对鳞翅目害虫具有较强的抗性。利用基因工程技术转入棉花中的Bt基因可以在棉花各组织器官中高效表达，合成对鳞翅目害虫具有高效毒杀作用的Bt蛋白。但若在生产上仍用常规栽培管理法，品种的产量潜力就不能正常发挥，甚至在不同的生态棉区造成产量显著降低。本文以市售Bt杀虫粉剂为原料，纯化、结晶出高纯度的Bt晶体蛋白，依此得到Bt蛋白抗体，制备出Bt蛋白试剂盒，并对转Bt基因抗虫棉与常规非抗虫棉进行了棉花在不同时空的抗虫性研究，旨在为抗虫棉的检测提供快速、有效的检测方法，并为抗虫棉的田间管理提供理论基础。其研究结果如下： 1.以市售的Bt蛋白粉剂为原料，采用碱解、层析和乙醇沉淀的生物化学的方法提取纯化Bt晶体蛋白。结果表明，在pH10.5时，碱解程度最高，采用60％饱和度的硫酸铵沉淀可以去除大多数的多糖，G-50层析柱将Bt蛋白(130KD)与其他蛋白分开，上清用1.2-1.5倍的95％乙醇沉淀，即可得到晶体状Bt蛋白，冻干称重，得率为1.338g/KgBt蛋白粉剂。考马斯亮蓝法测定蛋白纯度为91％，SDS-PAGE测定晶体蛋白的分子量为130KD。 2.采用实验室饲养棉铃虫的方法，棉铃虫的初孵虫、一铃虫、二铃虫48小时的死亡率为100％，三铃虫48小时的死亡率为88％，四铃虫48小时的死亡率为76％，生物活性达18000IU/mg。 3.实验用2Kg重的新西兰大白兔，采用免疫学制备抗体的方法，由兔血清以饱和硫酸铵沉淀提取蛋白，再以A-50层析后，加冷的95％乙醇沉淀制备抗体，所得抗体的滴度为32(琼脂凝胶扩散法)，完全可作为试剂盒使用(要求滴度不低于16)。 4.所制备的Bt蛋白试剂盒与进口的Agdia试剂盒做实验对比，结果表明：自制试剂盒Bt蛋白浓度线性范围为1750～28000ng·ml-1，而Agdia试剂盒Bt蛋白浓度线性范围为2250～36000ng·ml-1，可见自制试剂盒检测灵敏度比Agdia试剂盒的检测灵敏度稍高，但检测范围比Agdia试剂盒稍窄。自制试剂盒的精确度稍差，稳定性不是很好，有待进一步实验探索。 5.对转Bt基因抗虫棉与非抗虫棉在不同时间和不同的器官进行取样，用自制的Bt蛋白试剂盒检测(棉花叶取主干茎叶)，结果显示，同一时期，同一棉株上，倒1叶Bt毒蛋白含量较低，倒2叶较高，倒3叶最高，而倒5叶较倒3、4叶又有所下降，表明Bt基因在叶片中的表达产物随叶龄的变化而变化。在不同的生长时期，随着幼苗的生长，Bt蛋白的表达量也随之增加，均可达到抗虫的最低限度，特别是蕾期和结铃期，棉花叶中的Bt蛋白含量最高，但到吐絮期以后，Bt蛋白的表达量逐渐降低，棉花叶中的Bt蛋白含量最低，已经低于抗虫所要求的最低限度，不同生长时期棉花叶Bt蛋白表达趋势为：初花期＞蕾期＞花铃期＞苗期＞吐絮期。9种组织对棉铃虫初孵幼虫的抗性顺序为：功能叶＞嫩叶＞幼蕾＞幼铃＞幼叶＞花瓣＞花蕊＞苞叶＞老叶。 6.同一位置不同时期的棉花叶子(倒2叶，完全展开功能叶)，经ELISA检测结果显示：抗虫棉在生长初期，棉花叶子中Bt蛋白的表达就开始活跃，随着棉株的不断生长，抗虫棉的表达能力也逐步加强，到棉花的蕾期、花期达到最高点。但到了絮期以后，抗虫棉的表达量又开始快速下降，后期对Bt蛋白的表达水平远远低于抗虫棉生长初期的该蛋白表达平均水平。

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1文献综述

2引言

3材料与方法

4结果与分析

5讨论

6结论

参考文献

致谢

作者简介及在读期间发表的论文