玉米SBEⅡb不同类型RNAi载体的构建及原位转化方法的研究

摘要

玉米是一种重要的粮食作物，用途十分广泛。随着玉米加工业的快速发展，对玉米品质提出了更高的要求。传统的玉米育种改良已难以满足现代农业生产发展的需要，转基因技术与常规育种方法相结合可极大地加快作物的育种进程。但现有玉米转化方法均存在一定的局限性，成为转基因技术在玉米转化应用上的瓶颈之一。本研究通过构建两种淀粉分支酶干涉载体，以提高玉米胚乳直链淀粉含量；借鉴其它植物原位转化成功经验，探讨了原位转化技术应用于玉米转基因的效果，获得主要结果如下： 1.成功的构建了表达型双片段干涉载体p1300(bar)+HMW+2F(16+20)和单片段载体p1300(bar)+HMW+2F(16)，两种载体均含有胚乳特异性启动子(麦谷蛋白Glu启动子)，用于玉米胚乳的特异性表达。两种载体均含有bar基因作为选择标记，可以用于玉米转化子的田间大规模筛选。利用直接导入法将构建的干涉载体导入农杆菌LBA4404中，该转化菌可用于下一步的玉米转化。 2.确定了除草剂(PPT)对玉米幼苗(11～12d)适宜的筛选浓度。通过不同浓度PPT筛选玉米对照株，得出适宜筛选浓度为75μg/mL，利用此浓度筛选玉米植株，建立了用于转基因植株的大规模筛选体系，既能筛选出转化株，又能淘汰大部分非转化株。 3.探索了三种技术方法(棉球涂抹花丝法、剥皮去花丝涂抹法、剥皮去花丝涂抹+滴液法)用于玉米原位转化，结果表明最后一种方法效果最好，使用这种方法的处理组合之一的转化植株PCR阳性率达3.78‰，初步建立了适合于玉米原位转化的技术方法。 4.通过对剥皮去花丝涂抹+滴液法各单因素对转化率影响分析后，初步认为比较合适的处理培养基和处理方法是：200μnml/LAS+1/5MS大量元素+MS其它成分+2,4-Dlmg/L+10mmol/L果糖+10mmol/L葡萄糖+50g/L蔗糖+0.01％Tween20，诱导5h，每个果穗处理2次。 5.通过对部分T1代转化子玉米籽粒胚乳直链淀粉含量和PCR扩增试验表明，玉米籽粒胚乳直链淀粉含量较高(38％以上)的籽粒胚乳基因组PCR均呈阳性。使用双片段干涉载体p1300(bar)+HMW+2F(16+20)和单片段干涉载体 p1300(bar)+HMW+2F(16)转化获得的部分转化子玉米籽粒胚乳直链淀粉含量均较非转化对照高，但两种干涉载体干涉效果差异不显著。 综上所述，本研究成功地构建了两种干涉载体，并将其分别导入农杆菌LBA4404。通过对玉米原位转化方法进行探索，初步建立了适合于玉米原位转化的技术方法和转化体系。对T1代转化子胚乳直链淀粉含量的初步分析表明，两种载体干涉效果之间无明显差异。

目录

文摘

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文献综述

引言

材料与方法

结果与分析

讨论

结论

参考文献

附录

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