二十二碳六烯酸抑制炎症及内质网应激改善肺血管重塑

摘要

目的:肺高压(PH)是肺血管阻力持续升高，右心室负荷不断增加，进而导致进行性右心衰竭甚至死亡的常见严重并发症。近年来研究认为肺血管炎症及血管细胞内质网应激反应在PH的发生发展中起重要作用。二十二碳六烯酸(DHA)是n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFA)的主要成分，具有调节内质网应激及抗炎等效应。我们前期研究发现DHA能改善低氧性肺动脉高压。本研究拟采用野百合碱(MCT)诱导的大鼠肺高压模型，进一步探讨DHA的防治肺高压作用及其机制。　　方法:　　1.实验动物分组:SD(200-250g)大鼠40只，每组10只，随机分为4组:对照组（生理盐水注射），MCT造模组（腹腔单次注射MCT，4周），MCT造模组+DHA灌胃预防组（腹腔注射MCT当天即给予DHA灌胃，持续4周），MCT造模+DHA治疗组（腹腔注射MCT两周后给予DHA每天灌胃，持续2周）。　　(1)右心导管法检测各组大鼠肺动脉平均压;沿室间隔分离右心室(RV)，左室+室间隔(LV+S)分别称取质量，计算右心室肥厚指数:RV/(LV+S);(2)实时定量PCR检测肺组织细胞因子IL6，TNF-α，MCP-1及IL1β基因表达;(3)免疫组化法检测①肺动脉中膜厚度②肺组织及阻力性肺动脉周围CD3+T细胞及CD68+巨噬细胞计数;(4)免疫印迹法检测肺组织内质网应激相关蛋白表达水平;(5)免疫荧光双染检测内质网应激相关蛋白在肺组织中膜的表达差异。　　2.组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)并进行免疫荧光细胞鉴定。　　(1)免疫印迹及细胞免疫荧光检测PASMC内质网应激蛋白表达水平;(2)实时定量PCR检测PASMC的NFATc l-4基因表达水平;(3)免疫印迹检测NFATc1的总蛋白水平及核转移情况;(4) CCK8及BrdU摄入检测PASMC增殖;(5)流式细胞术检测PASMC细胞周期;(6)免疫印迹检测细胞周期相关蛋白表达水平。　　结果:　　1.与对照组大鼠相比，MCT组大鼠4周后平均肺动脉压显著升高(MCT:48.2+3.1mmHg vs control:20.5±1.3mmHg;p＜0.05);DHA预防及治疗可显著降低MCT诱导的PH大鼠平均肺动脉压（MCT+DHA预防组:25.3+2.1mmHg; MCT+DHA治疗组:31.5+3.4mmHg; p＜0.05vs MCT组）及右心指数（MCT+DHA预防组:0.37±0.02; MCT+DHA治疗组:0.42±0.01; p＜0.05 vs MCT组）;并显著抑制MCT诱导的大鼠肺动脉中膜增厚。　　2.DHA预防及治疗可显著减少MCT诱导的大鼠肺组织IL1β，TNFα，IL-6和MCP-1基因表达(p值均＜0.05);并抑制MCT诱导的大鼠肺组织及肺血管周围CD3+T细胞及CD68+巨噬细胞的聚集。　　3.DHA预防及治疗可显著减少MCT诱导的大鼠肺组织内质网应激相关蛋白p-IRE1，PDI和GRP78蛋白表达（p值均＜0.05）;免疫荧光双染表明DHA主要减少肺动脉平滑肌层PDI的表达。　　4.在培养的PASMC，PDGF-BB刺激能显著增加内质网应激相关蛋白p-IRE1，PDI和GRP78蛋白表达（p值均＜0.05）而DHA预孵能抑制PDGF-BB诱导的内质网应激相关蛋白的表达;免疫荧光表明PDGF-BB刺激PASMC后PDI荧光信号增强，而预孵DHA能减弱荧光信号。　　5.PDGF-BB刺激能诱导PASMC的NFATc1，NFATc2及NFATc3基因表达增加(p＜0.05 vs对照组)而对NFATc4无显著影响;预孵DHA能逆转PDGF-BB诱导的NFATc1及NFATc2的基因表达，而对NFATc3无显著影响。　　6.PDGF-BB刺激能诱导PASMC的NFATc1总蛋白表达增加，蛋白核转移增多，而预孵DHA及内质网应激抑制剂4-PBA能产生类似的抑制PDGF-BB诱导性NFATc1总蛋白表达增加及活性增强。　　7.PDGF-BB刺激PASMC能显著促进细胞周期蛋白cyclin D1表达，抑制G1期相关负性蛋白p21和p27表达，处于细胞周期S期百分比增多，细胞增殖增加;而DHA预孵或NFATc1 siRNA干扰能产生类似的抑制PDGF-BB诱导的cyclin D1表达增加，恢复p21和p27的蛋白水平，将细胞阻滞于G1期，抑制PDGF-BB诱导的PASMC的增殖。　　结论:　　1.DHA抑制MCT诱导的PH的肺组织及肺血管周围炎症反应。　　2.DHA抑制PDGF-BB诱导的PASMC内质网应激，减少PASMC增殖，改善肺血管重塑，降低MCT诱导的大鼠PH平均肺动脉压。

目录

声明

摘要

第一部分 DHA对野百合碱诱导肺高压大鼠血流动力学，右心指数影响及阻力性肺动脉中膜的影响

1．前言

1．1 二十二碳六烯酸的分子生物学特性

1．2 DHA在肺血管疾病中的作用

2 材料

2．1 仪器

2．2 试剂及材料

2．3 实验动物

2．4 主要溶液及成分

3 方法

3．1 实验动物分组及肺动脉高压模型制备

3．2 右心导管法检测肺动脉平均压力

3．3 右心肥厚指数测定

3．4 肺组织病理取材

3．5 标本处理

3．6 免疫组化染色

3．7 统计学分析

4 结果

4．1 DHA对肺高压大鼠mPAP及右心指数的影响

4．2 DHA对肺高压大鼠阻力性肺动脉中膜影响

5．讨论

小结

第二部分 DHA对野百合碱诱导肺高压大鼠炎症反应及内质网应激的影响

1 前言

1．1 免疫炎症在肺高压疾病中的作用

1．2 不饱和脂肪酸在炎症性肺部疾病中的作用

1．3 内质网应激参与肺高压疾病发生发展

1．4 DHA与内质网应激

2 材料

2．1 主要仪器

2．2 试剂及材料

2．3 实验动物

3 方法

3．1 实验动物分组及模型建造

3．2 病理取材及标本准备

3．3 免疫组化

3．4 免疫荧光双染

3．5 大鼠肺PASMC原代培养及细胞分组

3．6 平滑肌细胞鉴定

3．7 实时定量PCR检测相关基因表达

3．8 Western blot

3．9 统计分析

4 结果

4．1 DHA对大鼠肺组织MCP-1，IL-1β，TNF-和IL-6基因表达的影响

4．2 DHA对大鼠肺组织炎症细胞浸润的影响

4．3 大鼠PASMC的原代培养及鉴定

4．4 DHA对野百合碱诱导PAH大鼠肺组织内质网应激相关标志物表达的影响

4．5 DHA对肺动脉平滑肌细胞内质网应激相关标志物表达的影响

讨论

小结

第三部分 DHA对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖影响及机制

1 前言

1．1 DHA与血管平滑肌细胞

1．2 NFAT参与心血管疾病的发生发展

2 材料

2．1 主要仪器

2．2 试剂及材料

3 方法

3．3 实时定量PCR

3．4 Werstern Blot

3．5 大鼠NFATc1 siRNA的设计及干扰效率检测

3．6 大鼠肺PASMC增殖检测

3．7 流式细胞术检测周期

3．8 统计分析

4 结果

4．1 DHA对肺动脉平滑肌细胞NFAT基因表达的影响

4．3 NFATc1 siRNA转染肺动脉平滑肌细胞效率检测

4．4 DHA对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

4．5 DHA对肺动脉平滑肌细胞细胞周期的影响

4．6 DHA对肺动脉平滑肌细胞细胞周期相关蛋白表达的影响

讨论

小结

结论与展望

综述

参考文献

常用缩略词对照表

致谢

攻读博士学位期间的科研成果