3,3'二吲哚甲烷预处理人脐带间质干细胞在皮肤烫伤中的作用及机制

摘要

目的:皮肤烫伤破坏皮肤屏障功能，给患者带来触觉痛觉等障碍，且皮肤烫伤现有治疗方法效率不高，加速创面愈合至关重要。以间质干细胞为主的细胞治疗被广泛报道，利用小分子药物预处理间质干细胞可提高其在损伤修复中的治疗效率，加速损伤组织愈合。本文旨在研究小分子药物3，3'-二吲哚甲烷（3，3'-diindolylmethane，DIM）对人脐带间质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells，hucMSC)预处理后的作用，以期在皮肤烫伤中发挥更好治疗效果，并阐明DIM预处理hucMSC的分子机制。　　方法:MTT试验确定DIM作用的浓度和时间。体内构建SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型，以PBS和hucMSC为对照，观察DIM改造后hucMSC的治疗效果。创面大体照片，HE染色及组织学评分用以评价皮肤表皮再生及毛囊等附属结构再生情况。免疫组织化学染色检测损伤部位增殖细胞核抗原PCNA，免疫荧光染色检测角蛋白CK19表达，荧光定量PCR检测Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值，免疫组化检测皮肤组织β-catenin表达。体外探寻DIM对hucMSC预处理作用时，运用荧光定量PCR和Western blot检测hucMSC干性转录因子Oct4，Sox2，Nanog，Sall4表达情况。平板克隆检测hucMSC自我增殖能力，成脂诱导试验及成骨诱导试验检测hucMSC诱导分化潜能，定量PCR检测脂联蛋白adiponectin及碱性磷酸酶ALP表达，蛋白液相芯片技术检测hucMSC在DIM作用后旁分泌水平的改变。在研究DIM通过何种机制改造hucMSC时，采用荧光素酶报告基因检测Wnt信号通路的活化情况，免疫荧光及高内涵分析β-catenin的表达和入核情况。Westen blot检测β-catenin及其下游基因CyclinD3，CD44蛋白表达水平。使用β-catenin信号通路抑制剂ICG001进一步验证Wnt/β-catenin信号通路的作用，免疫荧光验证抑制剂抑制效果。平板克隆试验，成脂成骨诱导试验检测ICG001阻断β-catenin后，hucMSC自我增殖和多向分化的能力的改变。在进一步寻找关键Wnt分子时，荧光定量PCR筛选DIM作用后hucMSC中改变最为明显的Wnt分子。借助慢病毒载体干扰Wnt11基因的表达，定量PCR和Western blot验证慢病毒敲减效率。平板克隆，成脂成骨诱导试验检测Wnt11敲减后hucMSC自我增殖和多向分化能力的改变，并在体内模型中进一步验证。为了寻找Wnt11的有效传递形式，我们收集DIM处理过hucMSC的条件培养基，ELISA检测其中Wnt11分泌情况。用蔗糖密度梯度超速离心法提取上清中exosome。Western blot检测exosome表面标记物CD9，CD63，CD81，Nanosight分析对提取的exosome直径、分布、颗粒及表面标记进行鉴定。同时留取匹配的去exosome上清，ELISA检测exosome及去exosome上清中Wnt11表达情况。将不同处理的exosome和去exosome上清作用于皮肤细胞，检测皮肤细胞增殖和迁移能力的改变。　　结果:MTT结果显示hucMSC较肿瘤细胞对DIM显示出更强的耐受性，DIM IC50为158.11μM，我们选取既不损伤细胞活性又具有最强效应的浓度和时间，即50μM DIM作用hucMSC48小时。DIM预处理后的hucMSC(DIM-hucMSC)在体内明显加速大鼠深Ⅱ度烫伤修复，大体创面结痂脱落，表皮再生化完成，毛囊等附属结构增殖活跃，炎性浸润显著降低，组织学评分及治疗效率高于hucMSC治疗组。免疫组化检测结果显示DIM-hucMSC治疗组，损伤部位皮肤细胞增殖活跃。CK19表达及Ⅰ/Ⅲ型胶原表达比值均上调。免疫组化检测损伤组织中β-catenin的表达，DIM-hucMSC组也明显升高。体外检测DIM对hucMSC预处理作用，能明显上调其干性转录因子Oct4，Sox2，Nanog，Sall4的mRNA和蛋白表达水平，增强其核内表达。平板克隆和成脂、成骨诱导试验显示DIM-hucMSC较hucMSC呈现出更强的自我增殖和多向分化的诱导潜能，Adiponectin和ALP表达水平佐证了这一结果。蛋白液相芯片结果显示DIM-hucMSC旁分泌水平上调。荧光素酶报告基因检测显示DIM-hucMSC中Wnt信号活性增强，β-catenin表达上调且入核增加，转录稳定性提高。β-catenin信号通路抑制逆转了DIM-hucMSC中干性上调和旁分泌能力增强的作用，并在体内抑制了DIM-hucMSC的修复作用。慢病毒载体干扰Wnt11基因表达，Wnt11的干扰体外抑制了DIM-hucMSC中β-catenin的活化，体内削弱了DIM-hucMSC在烫伤组织中的治疗作用。收取DIM-hucMSC上清，发现上清同样具有上调hucMSC干性的作用。ELISA检测DIM-hucMSC上清中Wnt11分泌量增加，且去exosome上清中Wnt11表达含量较低。Exosome对Wnt11分子有效富集并成为其在细胞间传递，发挥生物学功能的主要活性形式。　　结论:DIM促进hucMSC中Wnt11蛋白的自分泌，活化自身Wnt/β-catenin信号通路，上调hucMSC自我增殖，多向分化和旁分泌水平，提高其在大鼠深Ⅱ度烫伤修复中的修复效率，为干细胞及干细胞成分治疗提供了新的方法和实验依据。

目录

声明

摘要

英文缩略词中英文注释表

第一章 绪论

1．1．1 间质干细胞

1．1．2 间质干细胞与组织再生修复

1．1．3 间质干细胞与皮肤组织再生修复

1．2 小分子药物调节干细胞生物学特性

1．2．1 小分子药物促进干细胞自我更新

1．2．2 小分子药物诱导干细胞多向分化

1．2．3 小分子药物调控干细胞再编程

1．2．4 小分子药物调控干细胞在损伤修复中的作用

1．2．5 小分子药物3，3’-二吲哚甲烷及其作用概述

1．3 外泌体Exosome

1．3．1 exosome的生物合成，释放和摄取

1．3．2 exosome的生物结构和功能

1．3．3 exosome介导的Wnt信号转运

1．4 Wnt信号通路

1．4．1 Wnt／β-catenin信号通路分子组成

1．4．2 Wnt信号通路在干细胞干性调节中的作用

1．5 科学问题的提出

第二章 研究目的、实验方案及意义

2．1 研究目的

2．2 实验方案设计

2．3 实验意义

第三章 小分子药物DIM预处理人脐带间质干细胞在大鼠深Ⅱ度烫伤中的作用

3．1 材料与仪器

3．1．1 所用细胞

3．1．2 所用动物

3．1．3 所用仪器

3．1．4 所用试剂及材料

3．2 实验方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 大鼠深Ⅱ度烫伤模型的建立

3．2．3 免疫组织化学染色

3．2．4 组织免疫荧光染色

3．2．5 MTT细胞毒性试验

3．2．6 细胞总蛋白的提取

3．2．7 Western blot蛋白印记

3．2．8 细胞总RNA提取，浓度测定及逆转录

3．2．9 荧光定量PCR

3．2．10 HE染色

3．2．11 统计分析

3．3 研究结果

3．3．1 小分子药物DIM作用时间及作用浓度的确定

3．3．2 DIM-hucMSC加速SD大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合

3．3．3 DIM-hucMSC促进了损伤表皮及皮肤附属结构的再生

3．3．4 DIM-hucMSC促进损伤皮肤组织中β-catenin的表达

3．3．5 DIM自身对大鼠深Ⅱ度烫伤的修复作用

3．4 讨论

第四章 DIM通过Wnt／β-catenin信号通路上调hucMSC干性及旁分泌水平

4．1 材料与仪器

4．1．1 所用细胞

4．1．2 所用试剂与材料

4．1．3 本章所用仪器

4．2 实验方法

4．2．1 RNA提取，浓度测定及逆转录

4．2．2 荧光定量PCR

4．2．3 Western blot

4．2．4 免疫荧光

4．2．5 平板克隆试验

4．2．6 成脂诱导

4．2．7 成骨诱导

4．2．8 荧光素酶报告基因检测

4．2．9 HE染色

4．2．10 免疫组织化学染色

4．2．11免疫组织荧光染色

4．2．12 Luminex液相质谱分析

4．2．13 流式检测细胞周期

4．2．14 统计学分析

4．3 实验结果

4．3．1 DIM上调hucMSC干性转录因子的表达水平

4．3．2 DIM促进hucMSC自我增殖和多向分化，并上调其旁分泌水平

4．3．3．DIM上调β-catenin的表达，促进其入核，增强转录活性

4．3．4 β-catenin信号通路抑制剂ICG001体外逆转DIM对hucMSC干性转录因子的上调

4．3．5 β-catenin信号通路抑制剂ICG001抑制了DIM-hucMSC自我增殖和成脂成骨诱导分化

4．3．6 β-catenin信号通路抑制剂ICG001抑制了DIM对hucMSC旁分泌水平的上调

4．3．7 β-catenin信号通路抑制剂ICG001体内逆转DIM-hucMSC的修复作用

4．4 讨论

第五章 DIM上调hucMSC中Wnt11的表达活化Wnt／β-catenin信号通路

5．1 材料与仪器

5．1．1 实验所用细胞

5．1．2 实验所用动物

5．1．3 主要试剂

5．1．4 实验仪器

5．2 实验方法

5．2．1 RNA的提取，浓度测定及逆转录

5．2．2 荧光定量PCR

5．2．3 Western blot

5．2．4 慢病毒干扰载体的构建

5．2．5 平板克隆

5．2．6 成脂诱导

5．2．10 免疫组织荧光染色

5．2．11 组织学评分

5．2．12 统计学分析

5．3 研究结果

5．3．2 Wnt11基因敲减逆转了DIM-hucMSC干性转录因子的表达上调

5．3．3 Wnt11基因敲减削弱了DIM-hucMSC的平板克隆和诱导成脂的能力

5．3．4 Wnt11敲减削弱了DIM-hucMSC在体内皮肤烫伤中的修复作用

5．3．5 Wnt11过表达促进β-catenin的表达

5．4 讨论

第六章 Exosome有效转运Wnt11活性蛋白

6．1 材料与仪器

6．1．1 实验所用细胞

6．1．3 实验仪器

6．2 实验方法

6．2．1 条件培养基的制备与收集

6．2．2 Exosome的提取(试剂盒提取法)

6．2．3 Western blot

6．2．4 平板克隆试验

6．2．5 荧光定量PCR

6．2．6 ELISA试验(达科为试剂盒)

6．2．7 划痕试验

6．3 研究结果

6．3．1 DIM-hucMSC条件培养基促进hucMSC干性上调

6．3．2 Exosome的提取与鉴定

6．3．3 Wnt11活性蛋白以Exosome的形式被转运

6．4 讨论

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

致谢

在学期间取得的科研成果