野葛异黄酮类化合物生物合成新途径酶学证据的初步研究

摘要

阐明植物的次级(生)代谢过程,是利用植物次生代谢产物进行医药工程及天然产物开发研究的前提和基础。与初级代谢相比,次级代谢是一个公认研究难度大,但又是潜力极大的研究领域。而在植物次生代谢的研究中,生物合成途径的研究属于机理研究范畴,是次级代谢研究的核心问题。因此,进行植物黄酮类化合物生物合成途径的研究,不仅可以揭示不同化学成分在植物体中的形成、转化及其相互关系的本质规律：而且对进一步利用现代生物技术方法进行黄酮化合物的生产也有着实际的意义。 野葛[Pueraria lobata(Willd)Ohwi.]分类学上属于豆科植物,是原产于我国的一种重要的野生植物资源,其主要生物活性成分为葛根素、大豆甙和大豆甙元等异黄酮化合物,含量(干重)高达7-8％以上,是大豆异黄酮含量(0.1-0.2％干重)的几十倍。野葛中异黄酮含量高的特点,易于次级代谢研究中产物的分离和检测；野葛悬浮细胞和野葛愈伤组织的成功培养,为开展的次级代谢研究建立了适宜的研究体系并提供了良好的研究基础,是进行植物黄酮类化合物生物合成途径研究的良好试材。 本论文实验以野葛培养细胞和野葛愈伤组织为研究体系,通过对预苯酸脱氢酶和对羟基苯丙酮酸还原酶活性与野葛离体培养体系中异黄酮化合物的生物合成的相关性研究,以及通过苯丙氨酸解氨酶(PAL)和对香豆酸连接酶(4CL)的专一性抑制剂处理实验,研究野葛离体培养体系中异黄酮化合物的生物合成以及异黄酮生物合成中可能的前体化合物预苯酸、对羟基苯丙酮酸和对羟基苯丙乳酸的积累情况,为以预苯酸为前体化合物,经对羟基苯丙酮酸、对羟基苯丙乳酸和香豆酸的中间代谢过程的一条异黄酮化合物生物合成新途径的证实提供酶学证据。实验取得以下主要结果： 在野葛细胞培养周期中,随着预苯酸脱氢酶和对羟基苯丙酮酸还原酶活性的提高,细胞培养体系中异黄酮的积累逐步增加,但异黄酮积累滞后于酶活的提高。通过对预苯酸脱氢酶和对羟基苯丙酮酸还原酶活性变化与野葛异黄酮化合物生物合成的相关性分析,结果表明两者具有较高的相关性,相关系数分别为0.8812和0.8046。 以野葛愈伤组织为试验材料,分别对PAL酶活性测定条件以及TTC法测定细胞活力条件进行了研究,结果表明,PAL的最适底物浓度为2 mM,最适pH值为8.8,最适反应温度为60℃,酶促反应产物可在2.5h内保持稳定。细胞活力测定的最适:TTC浓度为0.6％(w/v),最适pH值为7.5,TTC溶液处理的适宜时间范围为12～16h。 通过不同浓度的PAL专一性抑制剂(AOA)和4CL专一性抑制剂(MDCA)的处理实验,研究野葛愈伤组织的鲜重、干重、酶活、细胞活力和异黄酮含量的变化情况,得出AOA处理的适宜浓度为10μM,MDCA处理的适宜浓度为25μM。选取10μM为AOA处理的适宜浓度,设计了三种不同的AOA处理,即①培养0天的野葛愈伤组织、②培养24天(无AOA处理)以及③培养24天(10μM AOA处理),分别收集样品,进行异黄酮含量的分析测定,结果显示,处理③较处理①异黄酮含量高出6.141 mg·g-1,且有显著差异；而处理②较处理③高出18.197 mg·g-1,两者间具有极显著差异；研究表明野葛愈伤组织中可能存在其他异黄酮合成途径。同时,异黄酮含量(处理③-处理①)与异黄酮含量(处理②-处理③)的差异,则反映了两条不同途径在野葛异黄酮生物合成中的贡献大小,即通过苯丙氨酸-肉桂酸-香豆酸-香豆酰辅酶A-查耳酮的异黄酮生物合成途径为野葛愈伤黄酮生物合成的主要途径,而本项目研究的可能存在的异黄酮生物合成途径为野葛愈伤黄酮合成的辅助途径。其外,10 μMAOA处理条件下,野葛愈伤组织的预苯酸、对羟基苯丙酮酸和对羟基苯丙乳酸的含量都较对照的含量高,且差异极显著：表明AOA处理抑制了PAL酶活性以及异黄酮的生成,但具体机理不详。 培养第24天(25μM MDCA处理)野葛愈伤组织样品的异黄酮含量较培养0天的野葛愈伤组织样品中异黄酮含量高出2.217 mg·g-1,但两者差异不显著。同时,培养第24天的野葛愈伤组织(无MDCA处理)样品较培养第24天的野葛愈伤组织(25μM MDCA处理)样品高出22.251 mg·g-1,且两者具有极显著差异。表明4CL酶是异黄酮合成的关键酶,专一性抑制剂MDCA处理严重阻断了野葛愈伤体内异黄酮的生物合成。其外,25μM MDCA处理条件下,野葛愈伤组织的预苯酸含量都较对照的含量高,但差异不显著；而对羟基苯丙酮酸和对羟基苯丙乳酸含量都较对照的含量高,且差异极显著。同样表明MDCA阻断了香豆酸一香豆酰辅酶A的反应,进而阻断了黄酮化合物生物合成的途径,降低了异黄酮化合物的积累；并进一步通过反馈抑制作用,使得预苯酸、对羟基苯丙酮酸和对羟基苯丙乳酸含量都较对照有所增加。该研究结果也进一步证实了预苯酸、对羟基苯丙酮酸和对羟基苯丙乳酸为异黄酮生物合成的可能前体化合物。

目录

文摘

英文文摘

声明

1文献综述

1.1异黄酮生物合成途径的研究进展

1.1.1异黄酮类化合物的化学结构及性质

1.1.2异黄酮类化合物的生物合成途径

1.1.3异黄酮类化合物生物合成途径中相关酶(系)的研究

1.2一条异黄酮类化合物生物合成新途径假说的提出

2引言

2.1研究目的和意义

2.2研究内容和技术路线

2.2.1研究内容

2.2.2技术路线

2.3课题来源

3材料与方法

3.1材 料

3.2主要仪器设备

3.3实验药品

3.4实验方法

3.4.1预苯酸脱氢酶和对羟基苯丙酮酸还原酶的活性变化与野葛细胞培养体系中异黄酮生物合成的相互关系

3.4.2 PAL和4CL酶专一性抑制剂处理试验

4结果与分析

4.1预苯酸脱氢酶和对羟基苯丙酮酸还原酶的活性变化与野葛细胞培养体系中异黄酮生物合成的相互关系

4.1.1葛根素标准曲线

4.1.2野葛细胞培养周期中细胞鲜重和干重的变化

4.1.3对羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)催化反应产物的HPLC检测

4.1.4对羟基苯丙乳酸标准曲线

4.1.5预苯酸脱氢酶和对羟基苯丙酮酸还原酶的活性变化与野葛细胞培养体系中异黄酮生物合成的相关性分析

4.2 PAL酶活性测定及其性质的初步研究

4.2.1酶反应进程曲线

4.2.2底物浓度对野葛愈伤组织PAL活性的影响的分析

4.2.3酶浓度对野葛愈伤组织PAL活性的影响的分析

4.2.4 pH对野葛愈伤组织PAL活性的影响的分析

4.2.5温度对野葛愈伤组织PAL活性的影响的分析

4.3 TTC法测定野葛愈伤组织活力的研究

4.3.1 TTC浓度对愈伤组织活力的影响的分析

4.3.2 pH对愈伤组织活力的影响的分析

4.3.3 TTC溶液处理时间对愈伤组织活力的影响

4.4 PAL和4CL酶专一性抑制剂处理试验

4.4.1野葛愈伤组织的生长曲线及异黄酮合成的动力学曲线

4.4.2 PAL酶抑制剂AOA处理试验

4.4.3 4CL酶抑制剂处理试验

5结论与讨论

5.1结论

5.2讨论

参考文献

致谢

作者简介