小麦黄色素合成途径中Psy基因的克隆与分子特性及黄色素含量DH群体的构建

摘要

本研究以已经发表的玉米Psy基因为基础,从YPC差异显著的中国小麦品种(系)中克隆普通小麦Psy基因,并进行分子特性和YPC分析；同时选择YPC差异显著的小麦品种组配F1与玉米远缘杂交,诱导可进行黄色素含量遗传分析的小麦双单倍体(Double Haploid,DH)群体,旨在明确Psy基因对小麦YPC的影响、开发小麦YPC的分子标记,同时为小麦YPC的遗传分析、高(低)YPC小麦新品种的选育提供遗传材料和新种质。主要结果如下： 1.小麦黄色素合成途径中Psy基因的克隆及分子特性利用玉米Psy基因和小麦EST序列设计引物克隆小麦Psy基因并测序,同时和玉米Psy基因进行序列比对分析。结果表明,5对引物Psy01、Psy03～Psy06在YPC不同的小麦样品中分别扩增出989bp、785 bp、1192 bp、690 bp和302 bp的5条带,同一引物在不同YPC品种中的PCR产物序列一致,经比对分析,5条序列均为Psy基因(片段),并由此组装成一条全长3437bp、包括6个外显子和5个内含子的小麦Psy基因。文中以引物Psy04为例对其扩增的PCR产物进行了详细的分子特性分析。 2.小麦Psy基因的等位变异及其对黄色素含量的影响根据已发表的麦族植物Psy基因序列的保守区设计引物Psy02,克隆小麦Psy基因。结果表明,该引物下PCR产物出现3种带型：196bp、233bp和489bp,其中196bp和233bp条带涵盖了小麦Psy基因第2外显子全部序列,相差的37bp为Psy基因第2内含子中的一段插入序列,可反映不同YPC,属小麦Psy基因的等位变异。验证试验表明,248份试材(包括229份中国小麦微核心种质和19份品质性状典型的小麦品种)中有153份材料(占样品数的65.7％)扩增出196bp条带,群体内YPC均值7.314mg/kg,属高YPC范畴；另有95份材料(占样品总数的38.3％)扩增出233bp条带,群体内YPC均值为5.207mg/kg,属低YPC范畴,方差分析表明二者YPC差异达1％极显著水平差异,说明上述37bp的插入序列是导致小麦品种间YPC产生差异的原因之一,因此该引物扩增的Psy基因对小麦YPC具有显著影响,引物Psy02是对小麦YPC进行分子鉴定的重要标记。序列分析表明,196bp和233bp与设计引物的探针序列100％同源,489bp序列的BLAST搜索显示,与序列EU096094(未定位)的同源率最高,达97％,与7A染色体上序列EF600063和7B染色体上序列DQ642439的同源率均为85％,表明该基因片段可能为7A和7B染色体以外的另一Psy基因。结合该序列对应小麦品种的高YPC,推测该基因和7A染色体的Psy基因对黄色素含量存在积加效应。 3.普通小麦DD染色体上Psy基因的发现及其等位变异以扩增小麦Psy基因的相应引物Psy01～Psy06,在节节麦(2X=DD=14)中进行PCR反应。结果表明,仅引物Psy02和Psy06能扩增出特异条带。引物Psy02的扩增产物长206bp,与普通小麦中扩增的196bp序列同源率为93.0％,对应的第2外显子区域内仅有1SNP;引物Psy06的PCR产物长305bp,与普通小麦中扩增的302bp序列同源率达95.77％,对应的第6外显子区域内无SNP,说明在小麦DD染色组中存在Psy基因,同时也排除了将引物Psy01、Psy03、Psy04、Psy05的扩增产物和引物Psy02的489bp扩增产物定位于D染色体的可能。 4.小麦黄色素含量DH群体的构建为获得一定规模的小麦单倍体以构建小麦黄色素含量的DH群体,用高/低YPC小麦品种组配F1,F1再和玉米远缘杂交诱导小麦单倍体,研究了环境温度对单倍体成胚率、幼胚取材时期、幼胚大小、4℃处理时间、暗处理时间对单倍体成苗率的影响。结果表明,获得最高成胚率的环境温度为21～23℃,授粉后12～16天取材的幼胚成苗率无明显差异；0.5～1.0mm大小的幼胚成苗率显著高于0～0.5mm和1.O～1.5mm大小的幼胚成苗率；1～3天短期4℃处理对胚萌发具有一定促进作用,但处理3天后,出愈率和成苗率都将降低；胚培养过程中12天左右的24h暗处理能有效提高成苗率,在此基础上建立了一套高效、可靠、重复性好的小麦×玉米单倍体诱导系统。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1黄色素的生物学特性

1.1黄色素的主要成分

1.2类胡萝卜素(黄色素)的生物合成

1.3类胡萝卜素(黄色素)的重要生物学功能

1.4类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶八氢番茄红素合成酶Psy基因研究

2小麦黄色素研究进展

2.1小麦籽粒中黄色素的存在

2.2小麦籽粒中黄色素对面粉色泽的影响

2.3小麦籽粒黄色素的测定方法

2.4与小麦黄色素含量相关的遗传学基础研究

2.5小麦黄色素合成中关键酶基因Psy的基因定位

2.6小麦黄色素含量的遗传育种研究

2.7构建双单倍体DH群体对小麦黄色素含量遗传研究的意义

3构建小麦双单倍体DH群体研究进展

3.1单倍体胚的产生

3.2单倍体植株的形成

3.3单倍体植株的染色体人工加倍

3.4双单倍体的应用

4研究内容和研究意义

第二章小麦黄色素合成途径中Psy基因的克隆及分子特性

1材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2结果与分析

2.1 小麦Psy基因部分片段的克隆

2.2小麦Psy基因序列的分子特征

2.3小麦Psy基因编码的氨基酸序列分析

2.4 Psy基因的进化分析

3讨论

第三章小麦Psy基因的等位变异及对黄色素含量的影响

1材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2结果与分析

2.1小麦籽粒黄色素含量的变异及分布

2.2引物Psy02的PCR扩增结果

2.3引物Psy02扩增产物的序列分析及Psy基因的等位变异

2.4 7A和7B染色体外的Psy基因

2.5 Psy02引物在核心种质中的稳定性及对YPC进行分子鉴定的应用

3讨论

第四章利用节节麦(2X=DD=14)鉴定Psy基因及其等位变异

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1节节麦的表型特征和细胞学鉴定

2.2引物Psy01、Psy03、Psy04和Psy05的PCR扩增结果

2.3引物Psy02的PCR扩增结果和序列分析

2.4引物Psy06的PCR扩增结果

3讨论

第五章小麦黄色素含量DH群体的构建

1材料和方法

1.1亲本材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1不同环境温度对诱导单倍体的影响

2.2幼胚取材时期对单倍体成苗的影响

2.3幼胚大小对单倍体成苗的影响

2.4 4℃下不同处理时间对单倍体成苗的影响

2.5不同暗处理时间对单倍体成苗的影响

2.6单倍体的表型鉴定

2.7单倍体的细胞学鉴定

2.8用于小麦黄色素遗传研究的双单倍体DH群体的构建

3讨论

图版说明

图版

第六章结论

参考文献

致谢

个人简介及博士期间以第一作者发表的学术论文：

附表：229份中国小麦种质资源和19份品质性状典型小麦品种(系)的黄色素含量