有机磷农药毒死蜱降解菌玫瑰红红球菌mpd基因的克隆

摘要

毒死蜱是一种广谱性有机磷杀虫剂，被广泛用于农业和城市卫生害虫的防治。同时毒死蜱也是一种持久性污染物，其残留对环境和人类健康有很大的危害。寻求高效、安全、经济的农药残留生物降解处理新技术，解决病虫害防治用药与农药残留的矛盾，是科研工作者需要迫切解决的科研命题。本实验对已分离得到的毒死蜱高效降解菌，玫瑰红红球菌（Rhodococcus thodochrous） HW-D3菌株，进行降解基因的克隆，为构建基因工程菌做好前期研究。
　　 实验采用SDS-蛋白酶K法提取D3菌基因组DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有明显的RNA污染，加1μl RNase酶后可有效去除RNA，所提取基因组DNA片段大于15kb。用紫外可见分光光度计测基因组DNA的OD260为0.102、OD280为0.055，经计算，浓度为0.5151μg/ul；其OD260/OD280为1.8545，在1.8～2.0之间，没有蛋白质和RNA的污染。由此可看出本研究制备的基因组的DNA片段完整、纯度高、浓度大，可以满足构建基因组文库的要求。采用同样的方法分别提取培养12 h、24 h、36 h的D3菌基因组DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，培养24h所提的基因组条带最亮。
　　 本研究采用能切割4个核苷酸序列的内切限制酶Sau3AⅠ酶（8U/μl）对基因组DNA进行酶切，研究发现倍比稀释内切酶的方法比较容易寻找到最佳酶量，结果表明在第1管中加入1μl Sau3AⅠ酶进行倍比稀释后，37℃酶切30min，基因组DNA大量富集在1～6kb范围内，可满足切割2～4kbDNA片段的要求。计算得最佳酶切浓度为0.243U/μg、0.121U/μg、0.061 U/μg，按照这三个最佳浓度放大酶切体系，进行大量酶切反应，回收浓度和效率有较大的提高。
　　 用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收2～4kb的DNA片段，具有方便、快捷、稳定的特点，不需要酚抽提和乙醇沉淀，回收率在60％左右。
　　 取100μl的转化液涂布于LBS平板上，37℃培养18h后观察计数，白色菌落数量在70％-80％以上，转化效率达106 cfu/μg。采用高效感受态细胞DH5a常规转化，得到了近15000个转化子，远远超过了建库理论上需要的转化子。
　　 参照文献中已经报道的用于扩增毒死蜱降解菌YC-1 mpd基因的引物，以D3菌基因组DNA为模板进行PCR反应。经1％琼脂糖凝胶电泳，可以见到约为1kp的特异性电泳条带，与预计的大小相符，初步证明已成功的扩增出所需要的基因片段，将其回收克隆。PCR产物经纯化后，插入pMD18-T Vector载体的克隆位点，构建重组质粒。转化大肠杆菌DH5a后，取100μl涂布于LBS平板，白色菌落比率为96％。抽提克隆子的质粒，用XhoⅠ和NdeⅠ双酶切鉴定，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，插入片段条带大小正确。用气相色谱测含该重组质粒的大肠杆菌DH5a对毒死蜱的降解能力，24h后对20mg/L的毒死蜱降解率达39.36％，比出发菌D3降解率高。

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文摘

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声明

文献综述

1引 言

1.1毒死蜱残留的生态风险

1.2毒死蜱微生物降解研究概况

1.3本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1供试菌株和质粒

2.1.2药品与试剂

2.1.3仪器设备

2.2实验方法

2.2.1鸟枪法克隆D3菌降解基因

2.2.2 PCR扩增毒死蜱降解基因mpd

3结果与分析

3.1 D3菌基因组DNA的制备及电泳结果

3.1.1基因组DNA的提取

3.1.2菌体最佳培养时间的确定

3.1.3基因组的DNA纯度和纯度

3.1.4最佳部分酶切条件的选择

3.1.5胶回收DNA

3.2连接及结果检验

3.2.1转化率的计算

3.2.2蓝白斑筛选结果

3.3基因文库的构建

3.4 mpd基因的PCR克隆

3.4.1基因组DNA的PCR扩增

3.4.2 PCR产物的T-A克隆

3.4.3重组质粒的提取及酶切鉴定

3.5含重组质粒pMD-D的E.coil DH5a对毒死蜱的降解能力

4讨 论

5结 论

参考文献

致谢

作者简介及在读期间发表的学术论文