毒死蜱降解菌玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)HW-D3菌株遗传转化方法的研究

摘要

有机磷农药毒死蜱是一种具有显著环境毒性的化学物质，目前在农业生产中用量很大。玫瑰红红球菌（Rhodococcus thodochrous） HW-D3菌株可高效降解毒死蜱，是毒死蜱污染生物修复的优良菌株，可用于基因工程菌构建的研究。本实验获得以下主要研究结果。
　　 1．采用抗生素梯度平板法，测定了HW-D3菌株对常用抗生素的抗性。Chl、Km、Tc、Str、Ery、Amp和Neo对HW-D3菌株的最低抑制浓度（MIC）分别为：10μg/mL、3μg/mL、3μg/mL、0.5μg/mL、0.5μg/mL、4μg/mL、3μg/mL。HW-D3菌株在含30μg/mL Chl的LB培养基上可以生长但比较缓慢，对Km、Tc、Str、Ery、Amp和Neo六种常用抗生素比较敏感。几种抗生素都可以作为HW-D3菌株遗传转化的筛选压力。
　　 2．测定了HW-D3菌株的生长曲线和降解活性，0～12h为HW-D3菌株的延缓期，12～24 h为对数生长期，之后进入稳定期和衰亡期。培养48h时HW-D3菌株对毒死蜱的降解活性达到最高，而在细胞生长旺盛的对数期活性较低。
　　 3．HW-D3菌株有一定的自养能力．高浓度的毒死蜱会抑制HW-D3菌株的生长。实验中未发现水解圈等适合作为遗传转化筛选标记的菌落特征。
　　 4．采用碱裂解法中量提取HW-D3菌株的质粒DNA。HW-D3菌株细胞中有一个分子量约15kb的质粒，拷贝数较少，不易于分子生物学操作，不适合用于构建遗传转化载体。为降低载体构建难度，减少后续实验工作量，本实验以Toru Matsui等构建的Rhodococcus-E．coli穿梭质粒表达载体pNC9501为材料构建载体，并研究HW-D3菌株的遗传转化方法。
　　 5．采用pNC9501质粒成功转化E．coli5α菌株，转化率为1.01×102个转化子/μg质粒DNA。
　　 6．采用电转化和原生质体转化两种方法研究HW-D3菌株的遗传转化方法，但均未得到质粒pNC9501的阳性转化子，可能由于HW-D3菌株的限制性内切酶系统活性较高，阻碍了外源DNA的转入。有待进一步研究建立、完善HW-D3菌株的遗传转化方法。
　　 7．为研究HW-D3菌株在环境中的检测，本实验以E． coli WA803菌株为供体菌，以E． coli HB101菌株为辅助菌，采用三亲接合的方法把带有luxAB的pTR102质粒转入受体菌HW-D3菌株中，但未取得成功。
　　 8．采用真细菌通用FISH探针EUB338与纯培养的HW-D3菌株进行荧光原位杂交，杂交后的菌体亮度高，外形清晰，杂交率较高，表明HW-D3菌株细胞对该探针有较好的渗透性，探针可以进入细胞与rRNA分子杂交，为后续实验设计特异性探针进行杂交，进而在环境中原位检测HW-D3菌株提供了实验参数和技术基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词

声明

文献综述

1引言

1.1研究目的及意义

1.2国内外研究现状

1.3本研究要解决的问题

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2主要仪器与设备

2.1.3药品与试剂

2.1.4培养基

2.2实验方法

2.2.1 R.rhodochrous HW-D3菌株抗生素抗性测定

2.2.2 HW-D3菌株生长曲线和降解活性的测定

2.2.3 HW-D3菌株菌落特征的研究

2.2.4 HW-D3菌株质粒DNA的提取

2.2.5 HW-D3菌株的电转化

2.2.6原生质体转化法转化HW-D3菌株

2.2.7 luxAB标记HW-D3菌株

2.2.8 HW-D3菌株的荧光原位杂交(FISH)

3结果与分析

3.1 R.rhodochrous HW-D3菌株的抗药性

3.2 HW-D3菌株的生长曲线及降解率曲线

3.3 HW-D3菌株的菌落特征

3.4 HW-D3菌株质粒的提取

3.5 HW-D3菌株遗传转化方法的研究

3.6 luxAB标记HW-D3菌株

3.7 HW-D3菌株的荧光原位杂交

4讨论

5结论

参考文献

致谢

作者简介及在读期间发表的学术论文