IBV安徽分离株生物学特性及其遗传变异性的研究

摘要

传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病，主要引起鸡的呼吸系统疾病、肾炎、伴随产蛋量和蛋品质的下降，给养鸡业造成较大的经济损失。
　　 2007年～2008年从安徽省七个地区怀疑发生IB的鸡群中采集病料23份进行病毒分离，通过鸡胚接种、红细胞凝集活性试验、动物回归试验、鸡胚中和试验和RT-PCR等试验，确定10株分离病毒符合IBV的特征，所分离到的病毒株为IBV，分别命名为AH/HF1、AH/HF2、AH/HF3、AH/CZ、AH/FY、AH/LA、AH/CH、AH/AQ、AH/HN和AH/XC。
　　 采用固定病毒和固定血清稀释法，10株安徽分离株鸡胚血清中和试验表明：AH/HF2株属于Hotle血清型，与9株安徽分离株有交叉免疫反应，与其中5株分离株有完全交叉免疫反应；H120阳性血清只与2株安徽分离株有完全交叉免疫反应。通过对AH/HF2株和AH/HN株动物回归试验，病理剖检变化表明：AH/HF2株主要病变在上呼吸道、肾脏和腺胃，属于多致病型，而AH/HN株主要病变在小肠和腿肌，属于嗜肠型，这是安徽省报道腺胃型和肾型IB后新出现的两种临床类型。AH/FY株细胞适应能力的培养试验表明：AH/FY株能在Vero细胞中繁殖并产生细胞病变，但不能在CEF细胞中繁殖。
　　 应用RT-PCR方法对10株IBV分离株的主要结构基因进行扩增，PCR产物纯化回收、克隆、测序及分析。结果表明：10株分离株S1基因核苷酸序列由1617bp～1638bp组成，S2基因核苷酸序列由1878bp组成，M基因核苷酸序列由678bp～681bp组成，N基因核苷酸序列由1230bp组成。与我国IBV分离株、常用IBV疫苗株和国外IBV毒株的主要结构基因核苷酸序列及推导氨基酸序列进行比较，安徽IBV分离株的S1基因和M基因存在广泛的基因突变、缺失或插入现象，S2基因和N基因相对保守，只存在广泛的点基因突变。
　　 10株安徽IBV分离株基因同源重组分析，IBV分离株与我国江苏、河北、山东、吉林、黑龙江、新疆和广东等省份部分IBV分离株之间可能发生直接或间接发生同源重组。
　　 根据本研究的10株IBV分离株与我国IBV分离株、常用IBV疫苗株和国外IBV毒株的主要结构基因核苷酸序列同源性分析和系统进化树分析。安徽IBV分离株主要结构基因核苷酸序列之间具有较高的同源性为79.9％～99.9％，S1基因进化树分析，10株分离株分布在第Ⅰ群里的两个不同亚群，亲缘关系很近，形成了独立的基因进化群；与我国江苏、河北、山东、吉林、黑龙江、北京、新疆、广东和四川的部分IBV分离株同源性较高为81.5％～98.0％，亲缘关系也较近，它们之间组成不同的进化群；与我国常用疫苗株H120、M41、JiLin、D41、28/86、W93等毒株和国外IBV毒株（除韩国）同源最低为76.0％～91.7％，亲缘关较远，与10株分离株不在同一个进化群。

目录

文摘

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文献综述

1 鸡传染性支气管炎概述

2 IBV病原学研究

2.1形态特征

2.2理化特性

2.3血凝性

2.4干扰作用

2.5血清型分型

2.6宿住系统

3 IBV分子生物学的研究

3.1 IBV基因组结构

3.2 IB病毒主要结构编码蛋白及其功能

4 IBV遗传变异的研究

4.1 IBV分子遗传变异的机理

4.2 IBV分子遗传变异的影响因素

5 结语

引言

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料来源

1.1.2毒株

1.1.3实验动物和细胞

1.1.4阳性血清

1.1.5主要试剂

1.1.6培养基与抗生素及其配制

1.1.7主要仪器设备

1.1.8引物

1.2方法

1.2.1病料处理

1.2.2鸡胚传代

1.2.3鸡红细胞凝集试验

1.2.4 IBV分离株尿囊液RT-PCR鉴定

1.2.5动物回归试验

1.2.6鸡胚血清中和实验

1.2.7 AH/FY株对细胞适应能力试验

1.2.8 IBV分离株主要基因片段的PCR扩增与测定

1.2.9序列确定及分析比较

2结果与分析

2.1病毒分离

2.2尿囊液对鸡红细胞的凝集活性试验结果

2.3 IBV分离株尿囊液RT-PCR鉴定

2.4动物回归试验结果

2.4.1临床症状

2.4.2病理剖检变化

2.5鸡胚血清中和试验

2.5.1鸡胚半数感染量的测定

2.5.2鸡胚半数保护量(EPD50)的测定

2.5.3交叉中和试验

2.6 AH/FY株不同细胞适应性试验

2.7 IBV分离株主要结构基因片段RT-PCR扩增

2.8 IBV分离株主要结构基因序列的确定及序列分析

2.8.1 IBV分离株S基因序列的确定及序列分析

2.8.2 IBV分离株M基因序列的确定及序列分析

2.8.3 IBV分离株N基因序列的确定及序列分析

2.9 IBV分离株同源重组分析

3讨论

3.1 IBV分离株生物学特性的研究

3.1.1 IBV分离株的分离鉴定

3.1.2 IBV分离株的组织嗜性分析

3.1.3 IBV分离株血清型分析

3.1.4 IBV分离株对细胞适应能力的研究

3.2 IBV分离株主要结构基因变异情况

3.3 IBV分离株遗传衍化关系

结论

参考文献

致谢

个人简历