抗除草剂als、bar基因转化棉花华抗6号和06S62的研究

摘要

棉花是重要的经济作物，由于棉花生产长期受到杂草侵害，造成的直接经济损失占作物总产值的10％～20％左右。棉花基因工程的发展大大促进了抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆和高品质纤维等棉花品种的培育，但转基因棉花体系仍然存在着许多尚未解决的问题，如再生品种少、胚状体萌发率偏低、畸形率较高、再生周期长等问题，所以，不断发展新的再生体系和拓宽棉花转基因的品种数量是目前棉花基因工程发展的新趋势。
　　 本试验以六种不同基因型棉花为试材，探讨棉花再生过程中，各种因素对棉花组织培养再生体系的影响，以建立具有良好的稳定性和重复性、易于再生、有高再生频率的棉花基因转化受体系统。同时通过农杆菌介导法将抗除草剂als、bar基因转入棉花中，并对棉花茎尖遗传转化体系进行优化，为完善农杆菌介导抗除草剂棉花茎尖遗传转化技术，选育出抗除草剂的棉花新品种提供理论和实验基础。
　　 主要研究结果如下：
　　 1.从供试的六种基因型棉花中筛选出两种有胚性愈伤组织产生的基因型。分别是华抗6号和06S62。
　　 2.以华抗6号和06S62为材料，优化再生体系。愈伤组织诱导培养基的适宜配方为：MSB+30 g/L葡萄糖+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LZT+8g/L琼脂；分化培养基的适宜配方为：MSB+30g/L葡萄糖+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+8g/L琼脂；生根培养基的适宜配方为：MSB+30g/L葡萄糖+0.1mg/L6-BA+1.0mg/LNAA+10g/L琼脂+2g/L活性炭。
　　 3.农杆菌LBA4404转化als基因的适宜条件，华抗6号的菌液浓度OD6000.9、浸染时间为10 min、负压处理10 min、添加500μmol/LAS；06S62的菌液浓度OD6000.9、浸染时间15 min、负压处理15 min、添加500μmol/L AS。
　　 4.农杆菌LBA4404转化bar基因的适宜条件，华抗6号的菌液浓度OD6000.7、浸染时间为10 min、负压处理10 min、添加500μmol/L AS；06S62的菌液浓度OD6000.9、浸染时间15 min、负压处理15 min、添加500μmol/L AS。
　　 5.通过转化als基因，华抗6号获得了25株抗性幼苗，06S62获得了17株抗性幼苗，分别随机选取10株抗性幼苗，取叶片做PCR检测，均有阳性植株产生且最高转化率为5.71％。
　　 6.通过转化bar基因，华抗6号获得了30株抗性幼苗，06S62获得了22株抗性幼苗，分别随机选取10株抗性幼苗，取叶片做PCR检测，均有阳性植株产生且最高转化率为9.02％。

目录

文摘

英文文摘

声明

1文献综述

1.1棉花遗传转化的意义

1.2抗除草剂基因在棉花遗传转化中的研究进展

1.2.1抗除草剂基因als及其应用

1.2.2抗除草剂基因bar及其应用

1.2.3棉花抗除草剂基因遗传转化研究进展

1.3棉花遗传转化系统的研究进展

1.3.1农杆菌介导法

1.3.2基因枪轰击法

1.3.3花粉管通道法

1.4棉花遗传转化受体系统的研究进展

1.4.1棉花愈伤组织的诱导和培养

1.4.2植株再生

1.4.3影响棉花体细胞胚发生和植株再生的因素

2引言

3材料与方法

3.1实验材料

3.1.1植物材料

3.1.2农杆菌菌株和质粒

3.1.3主要溶液和培养基的配制

3.2主要仪器和试剂

3.2.1主要仪器

3.2.2主要试剂

3.3实验设计

3.3.1棉花无菌幼苗的培养

3.3.2棉花再生体系的优化

3.3.3农杆菌培养

3.3.4不同因素对转化率的影响

3.3.5茎尖转化与共培养

3.3.6转化植株的筛选

3.3.7 CTAB法提取棉花叶片DNA

3.3.8棉花转化植株的PCR检测

3.4实验测定及方法

3.4.1棉花再生体系优化中指标测定

3.4.2棉花茎尖转化体系优化中指标测定

3.4.3数据处理与分析

4结果与分析

4.1不同基因型棉花再生体系的优化

4.1.1基础培养基对愈伤组织诱导的影响

4.1.2碳源对愈伤组织诱导的影响

4.1.3碳源浓度对愈伤组织诱导的影响

4.1.4无机盐对愈伤组织诱导的影响

4.1.5琼脂浓度对愈伤组织诱导的影响

4.1.6激素对愈伤组织诱导的影响

4.2外植体类型对愈伤组织诱导的影响

4.3愈伤组织的继代、增殖及胚状体的形成

4.4棉花愈伤组织的茎尖分化和诱导生根

4.5转als棉花茎尖转化体系的建立和优化

4.5.1菌液浓度对转化率的影响

4.5.2浸染时间对转化率的影响

4.5.3负压处理对转化率的影响

4.5.4乙酰丁香酮对转化率的影响

4.6转bar棉花茎尖转化体系的建立和优化

4.6.1菌液浓度对转化率的影响

4.6.2浸染时间转化率的影响

4.6.3负压处理对转化率的影响

4.6.4乙酰丁香酮对转化率的影响

4.7棉花转化植株的PCR检测

5讨论

5.1棉花再生体系的优化

5.2农杆菌介导als、bar基因遗传转化体系的建立

5.3棉花基因型对遗传转化率的影响

6结论

参考文献

附录:缩略语表

致谢

作者简介及在读期间发表的论文