几株蛹草拟青霉原生质体制备及染色体核型研究

摘要

本文对蛹虫草无性型蛹草拟青霉的产孢培养基、酶解条件、原生质体制备等方面进行了研究，同时以温汉逊氏酵母Hansenula wingei YB-4662-VIA和粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe972h-染色体DNA作为标准指示样品，利用等强度均一电场(Contour-clamped Homogeneous Electric Field，CHEF)凝胶电泳技术比较了蛹草拟青霉菌株的电泳核型。
　　 培养基对菌株产孢量的影响实验中发现，除了菌株RCEF0848外基本上都以SMAY培养基最好，产孢量最大，菌株RCEF0848的产孢量以在察氏培养基上培养后的产孢量最大。
　　 酶解过程中存在着各种影响因素，包括酶的选择、酶反应温度、酶反应时间等。总体上混合酶液的效果好于单一酶类的作用效果。用相同浓度的蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶混合配成的酶解液酶解效果最佳；酶反应温度在30～35℃温度范围内，原生质体的产量相差不多，高于或低于这个范围时原生质体产量都会下降，但通过后期实验结果同时考虑到原生质体的质量，选择31℃为最适反应温度，在120r/min的条件下震荡处理2.48h即可获得大量的原生质体，为后续实验打下好的基础。
　　 原生质体产生过程中观察到一系列现象：原生质体在释放过程中体积变化较大，大小各不一致，前期产生的原生质体直径较小，后期产生的原生质体直径较大。原生质体在释放过程中主要有顶端、侧位、及原位三种释放方式，释放后期基本以原位释放为主。另外，还发现一种现象，即当两个原生质体靠的很近时，两者可以发生自然融合现象。
　　 经过对电泳条件的多次筛选，认为最理想的电泳条件是分两个阶段进行，以利于大小条带的分离。两个阶段分别从电泳时间、电泳液的温度、电泳缓冲液的种类、琼脂糖浓度、电压、脉冲转换的时间、转换的角度等方面考虑。第一阶段：时间为48h，温度14℃，电泳缓冲液1×TAE，琼脂糖浓度0.8％，电压2v/cm，脉冲时间20～30min，转换角度106°:第二阶段：16h，14℃，1×TAE，0.8％，3v/cm，500s,106°。
　　 以标准指示(marker)样品估算蛹草拟青霉的染色体大小和核型大小，结果为：蛹草拟青霉RCEF0096最小的染色体估算其大小为2.04Mb，最大的染色体估算大小为5.76Mb，整个染色体条带在31.0Mb以上；菌株RCEF4544染色体DNA最大及最小分别为5.69、2.04Mb，整个染色体条带在28.2Mb以上；菌株RCEF0848染色体DNA大小在2.0～5.7Mb，整个染色体条带在28.0Mb以上。故推算蛹草拟青霉基因组大小在28.0～31.0Mb。
　　 核型分析表明蛹草拟青霉种内各菌株间核型存在一定的差异，呈现明显的多态性，与其生存环境、寄主的多样性、以及培养过程中易退化等等因素有着微妙的关联。但各个菌株间最大染色体DNA大小和最小染色体DNA大小的估算值接近，同时条带的个数也是相同的。说明这种差异从某个角度来说是不那么显著的，这也与文献中指出的真菌电泳核型差异是种间大于种内、属间大于种间等相符。