禽类MHCⅡ类分子结构与抗病性关系和基于Ii-Key的病毒抗原免疫增强作用的研究

摘要

主要组织相容性复合体(MHC)是重要的抗原提呈类分子，而MHCⅡ类分子在成熟装配过程中其多态性α、β链与γ链(即恒定链，又称Ii链)组成的九聚体。其中α和β链对动物抗病/易感性有重要影响，而γ链则通过影响抗原提呈、B细胞分化和细胞因子分泌等方式影响机体免疫。本文主要研究了MHCⅡ分子的结构和α、β链的结构以及Ii链作为免疫载体的作用。
　　 首先，通过RT-PCR和重叠延伸PCR技术，扩增获得了3个品种地方鸡(淮北麻鸡、清远麻鸡和文昌鸡)80条MHCⅡα链和105条β链基因序列。通过序列的遗传学和结构学分析发现，鸡MHCⅡα在鸡群中的同源度达到了98％以上，而与其他物种的同源性则比较低，具体为68％(鸭)、76％(绵羊)、64％(人)和70％(小鼠)。在鸡群中MHCⅡβ链的同源性达到95％以上，与其它物种的同源性分别为93％(雉鸡)、89％(鹌鹑)、79％(鸭)、66％(人)和64％(小鼠)。
　　 进一步分析这3个品种的种群和个体间的MHCⅡβ链核苷酸序列差异性。发现三个品种平均单倍型多样性(Hd)分别为0.994，0.998，0.996，而平均核苷酸多样性(Pi)分别为0.03841，0.03856和0.004241。这说明三个品种鸡存在较高的等位基因多样性和较低的平均核苷酸多样性。根据Fst值据算出3个群体的平均基因流Nm为25-35，表明群体间的基因交流很频繁。根据Kimura2-parameter模型计算出，3个群体内的平均遗传距离为0.04-0.05，群体间为0.05，提示3个群体间的平均遗传距离与群体内的处于同一水平，没有体现群体的遗传分化。Tajima's D统计值说明3个品种进化方式为平衡选择，属于正向选择，这些选择有利于品种的进化。从105个序列中，我们获得了35个等位基因(GenBank No.HQ203691-HQ203725)。尽管所有序列都不同，但是一些等位基因在3个群体中的共享较高的比例。只有10个个体具有独特等位基因(9.5％，(10/105)。其它等位基因分布的频率较高，每个单倍有2-10个个体，约占90.5％(95/105)，其中有8个以上个体的为36.2％(38/105)。此外66个个体分布在12个等位基因中，其中的55个个体的11个等位基因只分布在两个品种，而另一等位基因的11个个体分布于3个品种。
　　 此外，鸡的MHCⅡα和β链与其它物种的结构极度相似，尤其是构成蛋白结构的主要氨基酸相似甚至相同。分析还发现，鸡与哺乳动物的MHCⅡ类分子遗传多样性相似，主要体现在MHCⅡβ链。这表现在不同物种的MHCⅡ类分子结构中高度变异和保守位点同时存在的特征，即鸡与人的MHCⅡ两条链在抗原结合槽和与TCR结构高度相似，尤其是在抗原结合位点与TCR链结合位点则保持了多态性，这既保证了与抗原结合的框架，又容许与多样性抗原的选择性结合。
　　 其次，研究了鹅Ii链的结构。Ii是MHCⅡ类分子的伴侣蛋白，在调节抗原提呈中起作用，也是重要的受体。迄今鹅的Ii基因特征及在组织中表达未见报道。通过RT-PCR和RACE克隆了鹅Ii cDNA，并用FQ-PCR检测了其mRNA在不同组织中的表达水平。两种Ii链cDNA被发现在各类组织中，它们分别被命名为GIi-1和GIi-2。前者的cDNA长为1，204lbp，含有一个由669bp组成的开放阅读框；后者的cDNA长度为1393bp，含有一个由858bp组成的开放阅读框。Ii-1与Ii-2在核苷酸和氨基酸水平上的同源性均为99％，两者的区别在于Ii-2比Ii-1多出一个Tg区。PCR和荧光定量PCR方法检测了鹅Ii基因在鹅不同发育阶段和不同组织中Ii的表达情况。PCR结果表明，Ii两种异构体在胚胎期和幼龄期的各个组织均有表达。而荧光定量PCR结果表明，Ii在幼龄鹅中的表达量高于胚胎期的表达量，而免疫组织如脾脏、胸腺和法氏囊中的表达高于在非免疫组织如心脏、肝脏和肺脏中的表达量。此外，分析鹅Ii基因与其他物种的系统发育树表明，与鸭、小鼠和人的相似性分别为92.3％、37.7％和39.8％。鹅和人的Ii分子的3-D结构比较，发现一些处于结构性关键氨基酸残基完全相同或相似，提示这些基团是组成重要结构，如β折叠所必须的。
　　 最后，对Ii链中具有载体作用的四肽片段(又被称作Ii-Key)增强免疫效果的机理进行了研究。应用激光共聚焦显微镜观察了分别由绿色和红色荧光蛋白标记的MHCⅡα和β链与所构建的含Ii不同片段(部分胞浆区、Ii-key四肽和CLIP尾端区)和抗原肽片段的Ii-Key结构在细胞内定位及与MHCⅡα和β链的结合特征。结果表明，Ii跨膜区部分片段的细胞定位作用是独立的，不依赖其他区。Ii三聚体区在与MHCⅡα/β聚合中具不可替代的作用，因为去除三聚体的片段失去了聚合作用。如果去除CLIP区，Ii也失去与MHCⅡ分子的聚合作用，但是用抗原肽替代可恢复其聚合作用。Ii与MHCII的α或β链都有聚合作用。最重要的是由四肽组成的Ii-key在体内实验中表现增强机体的抗体产生。经修饰的Ii-key(即加上胞浆区部分氨基酸或CLIP的下游两个氨基酸残基以及三聚体区)结构的增强作用更明显。结合这些结构在细胞内定位及与MHCⅡ分子的互相作用，提示Ii-key及修饰Ii-key的免疫载体作用是通过细胞内转运及与MHCⅡ分子的聚合，使抗原肽易于被MHCⅡ分子提呈。
　　 动物免疫实验表明，抗原肽(新城疫病毒F蛋白中3个表位，F306)携带Ii-key结构及其胞浆区起到了增强免疫效果的作用。携带Ii-Key的F306抗原肽(Ii-Key-F306)和携带CLIP尾部DN的F306抗原肽(Ii-Key-F306-DN)比单独的F306抗原肽免疫的抗体效价分别增强了约2和4倍；而增加跨膜区和胞浆区部分片段的抗原肽(Cyt-Tra-Ii-Key-F306)和再增加一个CLIP尾端-DN(Cyt-Tra-Ii-Key-F306-DN)抗体效价分别增加了8倍。如果单独用抗原肽F306取代CLIP区的Ii其抗体效价增加了2.5倍。