中国猕猴桃主产区溃疡病病原菌鉴定及其致病力检测

摘要

猕猴桃(Actinidia)原产于中国是一种非常珍贵的果树资源，在中国广大地区都有分布。由于猕猴桃适应性强，繁殖容易，对土壤的酸碱度等条件要求不严，一年种植多年受益，加之其经济价值较高、风味独特、用途广泛，特别是维生素C含量非常丰富，享有“果中之王”之美誉，因而被广泛种植。近年来，由于猕猴桃种植面积迅速扩大，猕猴桃细菌性溃疡病(Kiwifruit bacterial canker)传播迅速，病害威胁日益增加，危害程度日趋严重。猕猴桃溃疡病是一种由丁香假单孢杆菌猕猴桃致病种(Pseudomonas syringae pv.actinidae)引起的毁灭性病害，此病先后在日本、美国、韩国及意大利等国相继被发现。最近，在法国、葡萄牙、西班牙、瑞士、新西兰及智利等也了有相关报道。在我国，首先在湖南、安徽、陕西、四川等地区发现了此病，现已扩展到猕猴桃多数主产区，造成的经济损失惨重。
　　 本试验通过对中国不同区域猕猴桃溃疡病发病植株的枝条、叶片进行采集、对溃疡病病原菌进行分离和培养纯化，利用16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区序列(ITS)对细菌近缘种(related species)、致病品种(pathogenic variety)和菌株(strain)的区分和相关分子技术进行克隆测序，确定该菌为猕猴桃溃疡病病菌后，通过接种筛选相关猕猴桃抗病种质资源，为新品种选育和抗性资源的利用提供理论依据。
　　 研究主要结果如下：
　　 l、根据我们从安徽省岳西县、陕西省户县及重庆市黔江等猕猴桃主产区的调查发现，猕猴桃溃疡病主要为害猕猴桃的主干、枝蔓和叶片。在枝干上病部初期有乳白色的菌脓大量溢出、后变成红褐色的粘液附着在病斑表面，随后病斑上部枝条萎蔫死亡。在叶片上则表现为中间病斑深褐色、边缘有不规则的黄色近圆形病斑。
　　 2、从产区收集到的溃疡病感染枝条和树皮中共分离纯化得到10株分离物：SXQM、SXHWD、A18、A17、C33、SXHY、AKA5、AKB5、AK14、AK18。所有分离物均可使烟草叶片产生过敏反应，使猕猴桃品种健康叶片致病。猕猴桃叶片接种显示同一菌株对不同品种及不同菌株对同一品种的致病力均存在差异。
　　 3、将分离得到的菌株用16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区序列(ITS)进行分子鉴定。以分离物和意大利对照菌株的菌液做为模板，应用16S rDNA通用引物和特异引物PsaF1、PsaR2进行PCR扩增，均获得片段长度约1500 bp和300 bp的目的条带。将不同菌株PCR产物分别回收纯化，经测序分析发现，10株致病菌的DNA片段大小一致，均为1448bp和280bp，且序列相同。由此可见，所分离纯化的10株菌为同一致病菌。
　　 4、将16S rDNA的序列Blast比对、分析结果显示，该序列与丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种已报道的菌株GQ914994、AB001439、EU906856及AJ889840序列一致。通过将16S-23S rDNA的序列Blast比对、分析结果显示该序列也与丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种已报道的菌株JN172920.1、HM032088.1、D86357.1及AY342165.1等的16S-23S rDNA ITS序列一致。
　　 5、构建进化树，将分离物与丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种相近的物种进行聚类，16SrDNA聚类结果发现GQ914994、AB001439、EU906856及AJ889840菌株的亲缘关系最近，16S-23S rDNA结果发现JN172920.1、HM032088.1、D86357.1及AY342165.1菌株的亲缘关系最近，但是不能与丁香假单孢杆菌茶叶致病变种(P。syringae pv.theae)相区分。结合取样寄主和致病性检测结果，可以确定本试验分离所得菌株为丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种(P.syringae pv.actinidae)。