稻瘟菌P型ATP酶的基因家族分析及其基因MoCTA1、MoCTA3的研究

摘要

稻瘟菌是水稻的主要病原菌之一，是全球主要稻区最具毁灭性的病原菌，同时也是植物-真菌互作研究的模式真菌。稻瘟菌致病机理的研究，可以为制定稻瘟菌的持续管理策略和抗病品种的培育提供理论基础。P型ATP酶是一类位于质膜上的可以被ATP驱动并发生磷酸化的阳离子泵，在植物物质运输、细胞信号转导和细胞膜稳定性等方面具有重要作用。已有的研究表明，稻瘟菌的P-ATPase编码基因在其附着胞发育及致病性过程中具有重要作用。本文通过生物信息学方法，发现在稻瘟菌中存在有23个P-ATPase的编码基因；利用PCR的方法克隆了其中一个基因MoCTA3，并研究了其表达情况；通过基因敲除技术成功获得了MoCTA1基因的缺失突变体，并对其表型进行了分析。具体研究结果如下：
　　 1.通过数据库中P-ATPases的氨基酸序列对稻瘟菌的全基因组表达(CodingSequence，CDS)数据库进行搜索和分析，共发现有23个P-ATPases基因，进化树分析结果显示这23个基因分属于4个家族和7个亚家族。运用MEME程序分析这些P-ATPases蛋白的结构域，发现有6条基序在90％以上的氨基酸序列中均有出现。对这些基因的GC含量分析结果表明，它们的平均GC含量(0.519-0.62)，稍高于稻瘟菌整个基因组的平均值(0.516)，同时这些基因内各区段GC含量变化不大，没有明显的梯度变化。
　　 2.利用PCR的方法，从稻瘟菌中克隆了一个P-ATPase基因MoCTA3。对其进行了序列分析和氨基酸序列比对，并通过qRT-PCR检测了该基因在稻瘟菌侵染水稻叶片0h、48h、72h、96h，4个不同时期以及菌丝阶段的表达情况。结果表明该基因全长3747bp，含有6个外显子和5个内含子，编码1096个氨基酸，含有7个跨膜结构域，第24-98位有一个保守的钙离子转运结构域；与朱红丛赤壳、尖孢镰刀菌、蝗绿僵菌、炭疽菌等真菌的P-ATPase氨基酸相似性分别为77％、78％、83％和79％；基因表达结果显示该基因在菌丝阶段的表达量明显高于侵染阶段，侵染过程中随侵染时间延长表达量逐渐升高，72h时达到高峰，随后降低，说明MoCTA3可能参与了稻瘟菌的侵染过程，在稻瘟菌的致病性方面具有重要作用。
　　 3.通过基因敲除的方法得到稻瘟菌P-ATPase基因Mo6CTA1的缺失突变体。表型分析发现，在CM和PDA培养基上，⊿MoCTA1的气生菌丝生长致密，但生长速度与野生型相比却显著降低，而在产孢板上的气生菌丝疏松，生长速度无明显差异。GFP表达结果表明，MoCTA1的表达产物主要集中在孢子的隔膜上。喷雾接种结果显示，⊿MoCTA1的病斑小且不扩展，致病性下降。