贵州小型猪SLA经典Ⅰ类和Ⅱ类基因克隆和生物信息学分析及PCR-SSP分型方法的建立

摘要

猪的主要组织相容性复合体又称猪的白细胞抗原(swineleukocyteantigen)，它是位于猪的7号染色体上的是一组紧密连锁、高度多态并且与疾病抵抗和经济性状相关联的基因，它编码与免疫应答相关的一类细胞膜糖蛋白的基因簇，通常被分为SLAⅠ，SLAⅡ和SLAⅢ三个类群，其中SLAⅠ和SLAⅡ是最重要的经典分子。在人类器官移植中人源器官缺乏的今天，人们不得不将目光转移到猪身上：猪被认为是人类异种器官移植的理想供体动物，除其解剖组织学、器官形态大小和生理特征等与人相似外，更重要的是SLA和人的HLA具有高度同源性。近20年来，世界各国猪品种的SLA研究中已发现了大量等位基因，国际动物遗传学会(ISAG)建立了SLA等位基因及单倍型的系统命名体系。贵州小型猪源产自贵州省，有着体型小、性成熟早、遗传纯度高抗病力强等特性，是我国重要的宝贵种质资源。由于SLA的研究工作相对于人和鼠的MHC的研究起步较晚，深度不足，我国虽有着宝贵的小型猪物种资源，但在SLA研究领域落后于国外。因此，加快我国小型猪SLA的相关研究，促进与HLA比较分析，对推动免疫应答、动物疫苗、异种移植等领域的发展尤为重要。
　　 为确定贵州小型猪封闭群体中SLA经典Ⅰ类和经典Ⅱ类基因座位上的等位基因的分布和群体中存在的单倍型，本研究采用反转录、目的基因扩增、克隆、双向测序的方法对22头基础群个体的7个SLA基因座位上的基因进行了cDNA全长序列的克隆分析，并且将所得序列同国内外发现的基因序列进行了同源性进化分析，获得如下研究结果：
　　 1.在贵州小型猪封闭群中SLA-1基因座位上共发现了4条新的等位基因，将其命名为：SLA-1*gz01(accession：JQ361648)、SLA-1*gz02(accession：JQ361649)、SLA-1*gz03(accession：JQ361650)、SLA-1*gz04(accession：JQ361651)。经过进化树分析发现SLA-1*gz01、SLA-1*gz04这两个聚在了SLA-1*11等位基因组内；SLA-1*gz02(accession：JQ361649)聚在SLA-1*08等位基因组内，SLA-1*gz03(accession：JQ361650)聚在SLA-1*04等位基因组内。
　　 2.在SLA-2基因座位上共发现了5条等位基因，其中中4条为新发现的等位基因。将其命名为：SLA-2*gz01(accession：JQ361652)、SLA-2*gz02(accession：JQ361653)、SLA-2*gz03(accession：JQ361654)、SLA-2*gz04(accession：JQ361655)：另一条为已发现的等位基因SLA-B*m(Accession：AF464049.2)。经过进化树分析发现SLA-2*gz01(accession：JQ361652)被聚在了SLA-2*05等位基因组内，SLA-2*gz02(accession：JQ361653)被聚在了SLA-2*w08临时等位基因组内，SLA-2*gz03(accession：JQ361654)被聚在了SLA-2*11组中，SLA-2*gz04(accession：JQ361655)则与SLA-2*02组有着较近的进化关系。
　　 3.在SLA-3基因座位上共发现了4条等位基因，其中3条为新发现的等位基因，将其命名为：SLA-3*gz01(accession：JQ361656)、SLA-3*gz02(accession：JQ361657)、SLA-3*gz03(accession：JQ361658)；另一条为已发现的等位基因为SLA-3*0302(Accession：EU432097.1)。分析发现，SLA-3*gz01(accession：JQ361656)与SLA-3*gz03(accession：JQ361658)被聚于了SLA-3*04等位基因组中，SLA-3*gz02(accession：JQ361657)则被归于了SLA-3*05等位基因组中。
　　 4.在SLA-DRA基因座位上共发现了2条等位基因，其中1条为新发现的等位基因，将其命名为：SLA-DRA*gz01(accession：JQ361659)，另一条为已发现的等位基因为SLA-DRA*010103(Accession：EU432070.1)。分析发现，SLA-DRA*gz01(accession：JQ361659)与SLA-DRA*010101(Accession：BX088590)有着较近的进化关系。
　　 5.在SLA-DRB1基因座位上共发现了2条等位基因，在SLA-DQA基因座位上共发现了4条等位基因，在SLA-DQB1基因座位上共发现了4条等位基因，这些序列均为被发现的等位基因。它们分别是：SLA-DRB1*0901(Accession：EU432073.1)，SLA-DQA*yn(Accession：AY102475.1)，SLA-DQA*0301(Accession：EU722913.1)，SLA-DQA*0101(Accession：DQ883218.1)，SLA-DQB1*0801(Accession：DQ303219.1)，SLA-DQB1*113C3(Accession：AY135574.1)，SLA-DQB1*0901(Accession：EU432063.1)，SLA-DQB1*0601(Accession：DQ883219.1)，另外一个SLA-DRB1等位基因(Accession：AK347078.1)和一个SLA-DQA等位基因(Accession：AK230483.1)未被给予官方命名，我们将其临时命名为SLA-DRB1*gz01和SLA-DQA*gz01。
　　 6.在群体中我们共发现了2个SLAⅠ类和2个SLAⅡ类单倍型，其中一个SLAⅡ类单倍型(Hp-00.14)已经存在，另三个单倍型均为新发现的单倍型，将其分别临时命名为：Hp-gz01.00(SLA-1*gz01，SLA-3*gz01，SLA-2*gz01)；Hp-gz02.00(SLA-1*gz02，SLA-3*gz01，SLA-2*B*m)；Hp-gz00.01(SLA-DRA*gz01，SLA-DRB1*gz01，SLA-DQA*0101，SLA-DQB1*0601)。
　　 7.依据贵州小型猪群体中发现的等位基因的序列特征，我们设计了25条序列特异性引物，对5头子代个体进行了PCR-SSP方法的分型。发现子代个体中存在群体中的四种单倍型。