玉米西罗叶绿三酸铁螯合酶基因分离和功能研究

摘要

西罗血红素是最简单的功能四吡咯分子，它作为亚硝酸还原酶和亚硫酸还原酶的辅基，参与植物N和S的同化。西罗血红素的合成发生在质体中，经过甲基化、氧化、铁螯合三步反应。西罗叶绿三酸铁螯合酶是西罗血红素生物合成的关键酶，它是合成四吡咯分子的第二类螯合酶，它的活性不需要ATP参与。目前植物中仅有拟南芥西罗叶绿三酸铁螯合酶(SirB)的相关研究，本文初步研究了玉米西罗叶绿三酸铁螯合酶(ZmSFC)及其突变体ZmSFCM1、ZmSFCM2在大肠杆菌中的重组表达和纯化，并对ZmSFC及突变体ZmSFCM1的蛋白进行了光谱学和电子顺磁共振分析，通过荧光定量PCR分析了不同浓度硝酸盐或硫酸盐处理后玉米叶片中ZmSFC基因的表达情况。获得如下主要结果：
　　 1.提取玉米B73自交系叶片的总RNA，以反转录的cDNA为模板扩增出编码ZmSFC的成熟基因，插入pMF-Dute-1表达载体中，0.5mmol/L的IPTG，28℃诱导12h，Ni-NTA亲和纯化ZmSFC蛋白，SDS-PAGE显示纯化的蛋白为一条主带，亚基分子量大小约为18kDa。
　　 2.设计引物定点突变ZmSFC蛋白，第一轮突变一个氨基酸残基，获得突变体ZmSFCM1(C60A)，在第一轮的基础上进行第二轮突变，获得三个氨基酸残基突变的突变体ZmSFCM2(C60A，E42I，P43A)。分别对这个两个突变体进行蛋白的表达和纯化，SDS-PAGE显示纯化的蛋白亚基分子量大小与原蛋白表达一致。
　　 3.纯化得到的ZmSFC和ZmSFCM1蛋白进行光谱学分析，紫外可见光谱扫描显示，在315nm、415nm和519nm处有三处吸收峰，这三处吸收峰均为蛋白中含有铁硫簇的典型吸收峰，表明纯化的ZmSFC和ZmSFCM1蛋白中含有Fe-S簇结构。电子顺磁共振波谱表明纯化的ZmSFC和ZmSFCM1均含有[2Fe-2S]结构。这表明第一个保守的半光氨酸残基不参与Fe-S簇的形成。
　　 4.将ZmSFCM1和ZmSFCM2蛋白浓度超滤至12mg/mL，母液为20mmol/LTris-HCl，100mmol/LNaCl，pH8.0。采用悬滴法，HamptonScreenⅠ&Ⅱ98种筛选条件，在10℃恒温生长一周后，17号条件获得微晶，为棒状晶型。17号条件为：0.2M硫酸锂，0.1MTris-HCl，pH8.5，30％PEG4000。
　　 5.分别用不同浓度的硝酸钠和硫酸钾对玉米幼叶进行处理，25℃4h后，提取叶片总RNA，进行荧光定量PCR分析，结果表明：20mmol/L的NaNO3和50mmol/L的K2SO4处理后，玉米叶片中ZmSFC基因表达量最高。
　　 综上所述，本研究获得了玉米编码成熟ZmSFC的基因，获得两个突变体ZmSFCM1(C60A)和ZmSFCM2(C60A，E42I，P43A)，分析了它们在大肠杆菌中的重组表达，亲和纯化获得了蛋白，紫外可见光谱扫描和电子顺磁共振波谱表明纯化的蛋白中存在Fe-S簇结构，两个突变体的蛋白进行晶体生长，初步获得了微晶，荧光定量PCR表明低浓度的硝酸钠或硫酸钾处理后，玉米叶片ZmSFC基因表达量提高，高浓度处理基因表达量降低，这为后期酶活性的研究奠定了基础。