嗜热菌蛋白酶降解家蚕血清蛋白的机理研究

摘要

嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)是一种由病原微生物分泌的金属蛋白酶,它需要一个锌离子来维持其活性,四个钙离子来维持其结构的稳定性。嗜热菌蛋白酶属于金属蛋白酶M4家族中的一种,在很多动物致病菌和真菌中发现了这一家族的酶。因为它能够剪切寄主体内一些重要的蛋白而具有重要的毒力作用。对嗜热菌蛋白酶的研究到目前为止都是用纯化的蛋白在体外和该酶作用来了解它的毒力作用。本文中,我们以家蚕做为模式生物来研究它在一个复杂的生物背景中的作用方式。研究结果如下:
　　1.对家蚕幼虫注射嗜热菌蛋白酶会造成它们的死亡。对V-1的家蚕幼虫注射嗜热菌蛋白酶或胰蛋白酶。注射嗜热菌蛋白酶后的家蚕,血液不停的流出,且发生黑化现象,可能是因为破坏了它们的凝血系统。然而,注射胰蛋白酶后并不影响它们的凝血系统而且家蚕也不会黑化。
　　2.嗜热菌蛋白酶可以剪切纯化的rPPO1使其丧失活性。用嗜热菌蛋白酶或胰蛋白酶与纯化的rPPO1反应,没有检测到发现明显的rPO1活性。用嗜热菌蛋白酶或胰蛋白酶与微球菌诱导后的家蚕血清孵育结果显示,微球菌诱导后的家蚕血清没有酚氧化酶活性,用胰蛋白酶处理后的血清也不能产生酚氧化酶活性。而用嗜热菌蛋白酶处理后的家蚕血清可产生较高的酚氧化酶活性。这些数据表明,嗜热菌蛋白酶可以激活血清中的原酚氧化酶,但是对纯化的rPPO1却没有作用。这表明,嗜热菌蛋白酶是通过增加丝氨酸蛋白酶的活性来激活原酚氧化酶的。
　　3.嗜热菌蛋白酶不能直接激活丝氨酸蛋白酶。用胰蛋白酶处理α-胰凝乳蛋白酶原或α-胰凝乳蛋白酶,有很高的α-胰凝乳蛋白酶活性。然而,用嗜热菌蛋白酶处理α-胰凝乳蛋白酶原或α-胰凝乳蛋白酶并不能使其转变成为有活性的α-胰凝乳蛋白酶。这表明嗜热菌蛋白酶不可以切割α-胰凝乳蛋白酶原。用嗜热菌蛋白酶与α-胰凝乳蛋白酶原反应后,用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后考马斯亮蓝染色,显示α-胰凝乳蛋白酶原仍保持活性状态。然而,用胰蛋白酶处理α-胰凝乳蛋白酶原后,很大一部分条带消失了。这更加说明嗜热菌蛋白酶不可以剪切α-胰凝乳蛋白酶原。这表明嗜热菌蛋白酶不可以直接激活丝氨酸蛋白酶。
　　4.嗜热菌蛋白酶对哺乳动物血清的降解作用。在37°C和42°C下,嗜热菌蛋白酶可以降解哺乳动物血清如兔血清,人AB血清,胎牛血清和BALB/C鼠血清。在每个时间点,嗜热菌蛋白酶的降解血清的作用在42°C时比在37°C时更加明显,而相同酶活单位、相同剂量的胰蛋白酶对哺乳动物血清蛋白没有明显的作用。由此可见,嗜热菌蛋白酶对血清蛋白的降解是一个普遍的现象。
　　5.对嗜热菌蛋白酶作用的拟建模型。通常情况下,在动物血清中有很多serpin蛋白能够调控不同蛋白的活性。血清中的serpin能够抑制像胰蛋白酶这类丝氨酸蛋白酶的活性。然而,嗜热菌蛋白酶通过快速地、特异性的切割serpin,间接激活血清中的一些丝氨酸蛋白酶,加速对血清蛋白的降解。或者嗜热菌蛋白酶直接切割血清中的其它蛋白酶使它们有活性。因此,加入嗜热菌蛋白酶后对serpin的切割或者激活其它的蛋白酶是血清蛋白快速降解的原因。

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文献综述

1 嗜热菌蛋白酶简介

2 基因工程来表达重组的嗜热菌蛋白酶

3 嗜热菌蛋白酶研究展望

4 昆虫原多酚氧化酶简介

5 家蚕作为模式生物的研究

1 引言

1.1研究的目的及意义

1.2研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 主要试剂的配制5×SDS缓冲液 （10 L）

2.3 实验方法

3 实验结果与分析

3.1 嗜热菌蛋白酶注射家蚕引起家蚕死亡

3.2 嗜热菌蛋白酶对细胞不具有直接的伤害

3.3 嗜热菌蛋白酶在虫体内对血清蛋白的快速降解

3.4 在体外，嗜热菌蛋白酶导致家蚕血清蛋白的降解

3.5 嗜热菌蛋白酶可以快速剪切serpin-3

3.6 嗜热菌蛋白酶可以剪切rPPO1而没有活性

3.7 丝氨酸蛋白酶被激活并剪切血清中的原酚氧化酶

3.8 嗜热菌蛋白酶不能激活丝氨酸蛋白酶

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

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