小麦籽粒脂肪氧化酶活性功能标记的开发与应用

摘要

脂肪氧化酶(LOX)是影响小麦籽粒和面粉储藏特性的主要因素之一,通过降低小麦籽粒中的LOX活性可以有效地延长其储藏时间。目前主要采用生化检测的方法来测定小麦籽粒中的LOX活性,但此方法成本较高,完成一次检测的时间较长且选择效率低,不能检测育种早代材料中的LOX活性,因此本文试图通过研究小麦LOX基因遗传变异的规律,开发出小麦籽粒LOX活性的分子标记,来改良LOX活性。本试验对已公布的LOX基因序列进行了搜索和比对并设计引物,研究小麦籽粒LOX活性的功能标记,并用该标记分析了203份小麦品种(系)基因型与表型之间的关系。主要结果如下:
　　1、根据NCBI网站上已公布的小麦LOX基因(GenBankGU167920.1)序列,在不同位置设计了多对引物,以LOX活性差异较大的两组材料基因组DNA为模板进行PCR扩增,结果发现其中一对引物(LOX1-wp01)在高、低LOX活性材料中表现出多态性。引物LOX1-wp01扩增产物的电泳带型在两组材料间存在明显差异,其在高LOX活性的材料中均扩增出a、b、c三条带,在低LOX活性的材料中均扩增出a、c两条带。利用该标记检测203份小麦品种,结果表明有164个品种可以扩增出a、b、c三条带,占总样本量的80.79％,其LOX活性平均值为10.46nkat/g;39个品种扩增出a、c两条带,占总样本量的19.21%,LOX活性平均值为7.36nkat/g,方差分析表明两者的差异达极显著水平(P<0.01)。因此,认为LOX1-wp01可以在小麦LOX活性分子标记辅助选择中加以应用。
　　2、利用LOX1-wp01对203份小麦品种(系)的基因型进行检测,分别筛选到鹤麦026、内白、W1032、郑麦9405、鲁麦22、安农糯1、ZWY-10、周麦16、皖协497、烟农21等10份高LOX活性品种(系),LOX活性在14.65nkat·g-1~19.43nkat·g-1之间;周麦11、蒿优9409、淮麦19、内乡188、P206、陕228、扬辐麦5242、皖0606、安农95081-8、皖0202等10份低LOX活性品种(系),LOX活性在4.56nkat·g-1~5.93nkat·g-1之间。这些资源材料对于针对小麦LOX活性的品质改良研究具有一定的实际意义。
　　3、切取电泳条带a、b、c回收、测序,经Blast分析发现,a、b、c三条序列都与小麦LOX1基因存在高度同源性,a序列与硬粒小麦Lpx-B1.2(HM126467.1)基因序列重合区域为99%,相似率达100%;b序列与硬粒小麦Lpx-B1.1(HM126468.1)基因序列重合区域为100%,相似率达99%;c序列与硬粒小麦Lpx-B1.1(HM126468.1)基因序列重合区域为99%,相似率达96%。同时,a、b、c三条序列自身也存在高度同源。进一步分析发现,在所扩增的基因序列片段中存在3个内含子,所有内含子都符合内含子的GT-AG法则,且3条序列的差异区段都分布在这3个内含子之间。因此,本研究认为在普通六倍体小麦中LOX1存在3个位点,分别指定序列a为LOX1.2(GenBankJQ715610),序列b为LOX1.1(GenBankJQ715609),序列c为LOX1.3(GenBankJQ715611)。
　　4、通过对NCBI上注册的禾本科作物LOX基因序列的搜索与比对后发现,禾本科作物的LOX基因大体聚为四类,第一类包括L37359.1、HQ913602.1和DQ474244.1,都为LOX3基因;第二类包括NM001112503.1、X64396.1、L37358等7条LOX2基因;第三类包括HM126467.1、DQ474241.1、JQ715610等14条LOX1基因;第四类包括EU725461.1和AB099850.1两条LOX1基因。从分类上看,LOX1基因被分为了两类,即第三类和第四类,水稻属的两条LOX1基因(EU725461.1和AB099850.1)单独被分为了一类,表明水稻属LOX1基因的亲缘关系与其他禾本科作物LOX1基因的亲缘关系较远。另外,对上述前三类进一步分析,认为小麦属LOX基因与大麦属LOX基因的亲缘关系最近。
　　5、根据同源性设计引物,采用RT-PCR技术,克隆到六倍体普通小麦LOX1基因cDNA片段,大小为384bp,推导氨基酸残基为127个,分子量为11.15kD,等电点pI为4.93,与杜伦小麦、大麦、高粱、水稻的相似率分别为99.7%、94.8%、73.7%、56.2%,结果表明亲缘关系相近的物种之间核苷酸序列差异小且遗传距离也小,亲缘关系较远的物种之间核苷酸序列差异较大,遗传距离较远。可见,物种之间的核苷酸序列差异程度与它们的亲缘关系远近密切相关。与传统分类学上物种亲缘关系的远近结果相符,表明得到的LOX1片段序列可以作为研究禾本科作物亲缘关系或遗传距离的参考标记之一。

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1 文献综述

1.1 脂肪氧化酶概述

1.3 脂肪氧化酶活性与小麦储藏特性的关系

1.4 小麦脂肪氧化酶的基因组学研究

2 引 言

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 统计分析

4结果与分析

4.1小麦籽粒脂肪氧化酶基因STS分子标记的研究

4.2 小麦LOX1基因cDNA片段克隆及分析

5 讨 论

5.1 关于小麦籽粒LOX基因STS分子标记及其开发与应用

5.2 关于分子标记LOX1-wp01的应用前景

5.3 关于小麦LOX1基因cDNA片段克隆与序列分析

6 结 论

参考文献

附 录

致谢

作者简介

在读期间发表的学术论文

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