抗日本血吸虫病双价共表达DNA疫苗pVAX1/SjCB·hIL-18的构建及其动物保护性研究

摘要

本实验室前期的研究己证明，日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)(主要是26-28kDa组分)和成虫抗原31/32kDa蛋白（Sj31/32）天然分子免疫动物均可诱导产生较好的抗雌虫生殖、抗卵胚发育的效果。对Sj31/32蛋白的质谱和序列测定发现20号蛋白质点与曼氏血吸虫组织蛋白酶B内肽酶（SmCB）高度同源。CB参与对宿主血红蛋白的分解，与血吸虫的生殖、发育有关。但由于天然分子的批量制备相对困难，束缚了其在实际中的应用。本课题组一直致力于筛选、鉴定天然分子疫苗的编码基因，前期研究已成功构建了几种天然分子疫苗相关的核酸疫苗，其中包括Sj31/32kDa相关的pcDNA3.0/SjCB，并证实对小鼠能产生一定的保护力。但血吸虫虫体抗原多样，感染后免疫机制复杂，目前尚未有令人满意的、具有较高免疫保护作用的血吸虫新型疫苗。近年来，研究者除了不断筛选鉴定候选疫苗外、还希望从载体、佐剂及免疫途径和免疫方法等多方面得高血吸虫DNA疫苗的免疫效果。其中以重组质粒形式表达并可在体内持久存在的细胞因子，在DNA疫苗新型佐剂的研究领域引起了广泛的兴趣与关注，白介素-18(IL-18)就是近期免疫佐剂研究的一个热点。IL-18又叫γ干扰素诱导因子，主要能刺激T细胞及NK细胞产生IFN-y,IL-12等多种细胞因子，刺激ThO细胞向Thl细胞分化，可增强Thl型免疫反应，增强机体抗血吸虫病的免疫保护力。传统的IL-18免疫治疗是通过血液循环到达免疫原局部而起作用，这种治疗必须连续、大剂量用药，势必导致毒副作用增加及宿主体内细胞因子失衡。本研究旨在将具有抗雌虫、抗卵功能的SjCB和具有免疫佐剂作用的hIL-18两种目的基因构建在同一真核载体pVAX1上形成双价疫苗pVAXl/SjCB.hlL-18；观察其免疫小鼠后hlL-18能否提高SjCB对小鼠的免疫保护力。　　 研究目的：1、分别构建单价疫苗pVAXl/SjCB与pVAXl/hlL-18以及双价疫苗pVAXl/SjCB.hlL-18，获得良好的表达；　　 2、观察并比pVAXl/SjCB.hlL-18免疫小鼠后，hIL-18是否起到免疫佐剂增强抗日本血吸虫攻击感染的保护效果。研究方法1、单价疫苗pVAXl/SjCB与pVAXl/hlL-18及双价疫苗pVAXl/SjCB.hlL-18的构建。　　 分别以pQE30/SjCB、pET32a/hlL-18为模板，设计引物扩增SjCB、hIL-18，用overlap法扩增全长的SjCB·hlL-18，分别将扩增产物鉴定后与真核质粒载体pVAX1连接，转化至DH5α细胞。对三种阳性克隆鉴定并测序验证其完整性。　　 2、单价疫苗pVAXl/SjCB、pVAXl/hlL-18和双价疫苗pVAXl/SjCB·hlL-18的表达，及其对小鼠的免疫保护效果观察。　　 10只昆明小鼠随机分成5组（每组2只）：A组为pVAXl/SjCB·hlL-18双价疫苗组，B组为pVAXl/SjCB免疫组，C组为pVAXl/hIL-18免疫组，D组为pVAX1对照组，E组为NS对照组。分别提取以上质粒，以100μ/只经左腿股四头肌注射昆明小鼠，14d后取肌肉组织切片进行酶免疫组织化学染色，观察其表达。　　 50只昆明小鼠随机分成5组（每组10只）（A-E组同上），大量提取取以上质粒，每只小鼠100μg或100mLNS经左腿股四头肌注射进行免疫。四周后以20+-1条尾蚴贴腹感染，感染6周后检测减虫率、减卵率。　　 研究结果：1、PCR、EcoRI和XhoI双酶切及测序均显示重组质粒的插入序列分别与目的基因ORF完全一致，说明单价疫苗pVAXl/SjCB、pVAXI/hIL-18和双价疫苗pVAXl/SjCB.hlL-18构建成功。　　 2、昆明小鼠肌肉组织酶免疫组织化学染色显示免疫组小鼠肌细胞中呈现较明显的棕黄色颗粒，而对照组肌细胞无此特异性。证实pVAZl/SjCB、pVAXl/hIL-18、pVAXl/SjCB.hIL-18均能在小鼠肌肉细胞内成功表达。　　 3、pVAXl/SjCB·hIL-18、pVAXl/SjCB、pVAXl/hIL-18免疫小鼠后分别获得了41.32％、32.56％、15.17％的减虫率，49.55％、43.04％、27.21％的每雌子宫减卵率和72.35％、50.08％、14.86％的每克肝减卵率，与NS组比较各组均有显著性差异(P<0.05)；pVAXl/SjCB'hlL-18、pVAX1/SjCB、ppVAXl/hlL-18各免疫组与相应的空质粒组相比各指标均具有显著性差异（P<0.05）；双价疫苗pVAX1/SjCB'hlL-18与单价疫苗pVAXl/SjCB相比，减虫率、肝减卵率、每雌子宫减卵率相比均有显著性差异（P<0.05）；单价疫苗pVAXl/SjCB组与pVAXl/Hll-18组相比，减虫率无显著性差异(P>0.05)，但肝减卵率和每雌子宫减卵率均有显著性差异(P<0.05)。　　 结论：1、真核重组质粒pVAXl/SjCB、pVAXl/hlL-18和pVAXl/SjCBhIL-18构建成功。　　 2、真核重组质粒pVAXl/SjCB、pVAXl/hlL-18和pVAXl/SjCB·hlL-18在小鼠肌肉细胞内获得良好表达。　　 3、单价疫苗pVAXl/SjCB与双价疫苗pVAXl/SjCB·hlL-18免疫小鼠均能产生较好的保护力；双价疫苗pVAXl/SjCB·hIL-18可以产生比单价疫苗pVAXl/SjCB更高的免疫保护效果，说明IL-18作为佐剂可增强血吸虫核酸疫苗的免疫保护作用。