非对称二甲基精氨酸(ADMA)对糖尿病红细胞变形能力及胰岛素抵抗的影响

摘要

第一章 研究背景 红细胞变形能力下降可引起微循环灌注障碍，参与糖尿病血管并发症的发生与发展。研究表明，信号分子一氧化氮（NO）参与红细胞变形能力的调节。不对称二甲基精氨酸（ADMA）是机体内NO合成的内源性调节物质，可通过抑制内皮细胞NO生成而引起内皮依赖性血管舒张功能障碍。最近的研究显示，高血压病人红细胞膜流动性与血浆ADMA升高呈负相关，但ADMA对红细胞变形能力的确切影响及作用机制未明。基于糖尿病时红细胞变形能力下降以及血浆ADMA含量增加，本实验拟在STZ诱导的糖尿病动物模型及离体实验，探讨糖尿病红细胞变形能力降低是否与ADMA有关；在此基础上，进一步探讨ADMA的作用机制。 研究方法 （1）SD大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素STZ（65mg/kg）诱导实验性糖尿病，检测不同病程（2，4，8周）NO（硝酸还原酶法）、ADMA（HPLC）及红细胞变形能力（激光衍射法）的变化； （2）取离体的糖尿病大鼠腹主动脉环，与健康SD大鼠的红细胞共孵育，观察红细胞变形能力的变化；在此基础上，进一步观察左旋精氨酸（L-arginine，L-arg）预处理能否改善糖尿病大鼠动脉环孵育对红细胞变形能力的影响； （3）外源性应用ADMA孵育红细胞，检测ADMA对红细胞变形能力、NO、ROS（DCFH-DA荧光法）、MDA水平（比色法）。在此基础上，进一步观察左旋精氨酸（L-arg）或维生素E（vitaminE）能否对抗ADMA的作用。 研究结果 （1）糖尿病大鼠成模4周后，红细胞变形能力开始降低。血浆与红细胞中ADMA以及红细胞中脂质过氧化产物MDA水平则随着病程延长而逐渐增加。血浆中NO无明显变化，但成模8周后红细胞中NO含量降低。 （2）与对照组相比，糖尿病大鼠胸主动脉环与红细胞共孵育30分钟后明显降低红细胞变形能力。左旋精氨酸（10-5M）预处理可改善糖尿病大鼠血管环孵育后红细胞变形能力的下降，而单用左旋精氨酸处理则与对照组相比无显著差异。 （3）ADMA孵育红细胞后可时间与剂量依赖性降低红细胞变形能力。ADMA（10-6M）处理30分钟，红细胞中NO生成降低，而MDA与ROS水平升高。左旋精氨酸预处理可逆转ADMA处理后红细胞内NO含量降低，而维生素E则可对抗ADMA所致的MDA与ROS生成增加。左旋精氨酸与维生素E红细胞变形能皆可改善红细胞变形能力。 结论 糖尿病红细胞变形能力降低与ADMA水平升高有关，其机制可能涉及ADMA对血管及红细胞源性NO生成，以及对红细胞氧化应激的影响。 第二章 研究背景 胰岛素抵抗是2型糖尿病、多囊卵巢综合征等疾病的重要特征，可表现为肝脏、肌肉、脂肪组织等对胰岛素敏感性下降而导致胰岛素生物效应低于正常。脂肪组织除了储存脂肪与能量外，还具有强大的内分泌功能，可分泌多种细胞因子调节自身能量代谢与胰岛素敏感性。研究表明，血浆ADMA与胰岛素敏感性之间存在着潜在的关联，而脂肪细胞内亦存在与ADMA代谢有关的酶系，可合成与分泌ADMA。因此，本研究拟通过高脂加STZ诱导的胰岛素抵抗糖尿病动物模型及高糖诱导的胰岛素抵抗脂肪细胞模型，运用二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）基因过表达技术，探讨糖尿病时脂肪细胞DDAH/ADMA系统与胰岛素抵抗之间的关联。 研究方法 （1）在高脂饲养加小剂量STZ（35mg/kg）诱导的胰岛素抵抗糖尿病大鼠模型，检测脂肪组织中DDAH、ADMA的变化，分析其与胰岛素敏感性之间的关联。DDAH表达采用免疫组化及实时定量PCR法检测，DDAH的活性以降解ADMA的量间接评价。 （2）高糖处理体外培养小鼠来源的3T3-L1脂肪细胞，检测高DDAH、ADMA以及胰岛素受体底物-1（IRS-1）及葡萄糖转运体-4（GLUT4）mRNA表达，在此基础上，观察人类DDAH基因（hDDAH）过表达（瞬时转染pEGFP-C1-hDDAH2过表达质粒）能否对抗高糖对IRS-1与GLUT4的影响。小鼠DDAH1、DDAH2、IRS-1与GLUT4的mRNA表达采用实时定量PCR的方法，hDDAH的表达采用RT-PCR结合琼脂糖电泳检测。 研究结果 （1）SD大鼠经高脂饲养加小剂量STZ诱导后，经检测血糖、血浆胰岛素，进行OGTT实验及计算HOMA胰岛素抵抗指数，确证伴有胰岛素抵抗的2型糖尿病模型成立。糖尿病大鼠血中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）及低密度脂蛋白（LDL）升高，而高密度脂蛋白（HDL）及体重降低。 （2）与对照组相比，糖尿病大鼠脂肪组织中DDAH2表达、DDAH与NOS活性、NO水平显著降低，而ADMA含量升高，伴随着IRS-1、GLUT4mRNA表达下调。 （3）相关分析表明，脂肪组织中DDAH及NOS活性、NO含量与血糖、OGTT曲线下面积、HOMA抵抗指数呈负相关，且与血浆胰岛素水平正相关。ADMA则与血糖、OGTT曲线下面积及HOMA抵抗指数正相关。 （4）高糖处理72小时可下调脂肪细胞中DDAH2表达，而渗透压对照组对DDAH表达无明显影响。 （5）瞬时转染hDDAH2基因后再予以高糖处理72小时，可见转染组hDDAH2mRNA表达增加，而空质粒转染对照组中未检测到hDDAH2mRNA表达。hDDAH基因过表达可增加脂肪细胞中DDAH活性，并且降低ADMA含量。 （6）高糖处理可下调脂肪细胞中IRS-1与GLUT4mRNA表达，而hDDAH基因过表达则可对抗高糖对IRS-1与GLUT4的抑制作用。 结论 糖尿病胰岛素信号转导障碍可能与脂肪组织DDAH表达/活性降低及ADMA含量增加有关，ADMA可能是诱导胰岛素抵抗的新的脂肪细胞因子。 第三章ADMA诱导脂肪细胞胰岛素抵抗及机制研究 研究背景 既往的研究表明，ADMA与葡萄糖代谢及胰岛素敏感性存在关联，我们前期研究也发现脂肪组织源性DDAH/ADMA系统参与胰岛素信号转导的调节。然而，DDAH/ADMA系统影响胰岛素信号转导的机制目前并不清楚。 大量研究证实，在胰岛素抵抗的发生过程中，氧化应激与炎症反应是重要的发病机制，且氧化应激与炎症之间存在关联。文献报道，炎症因子Toll样受体4（TLR4）介导的炎症反应受活性氧自由基（ROS）调节。近年来研究显示，内源性一氧化氮合酶抑制物ADMA除降低NO生成外，还可诱导ROS及炎症因子生成。因此，本研究拟通过外源性应用ADMA以观察ADMA能否诱导脂肪细胞胰岛素抵抗，并进一步探讨其机制是否涉及氧化应激/TLR4炎症途径。 研究方法 （1）3T3-L1前脂肪细胞促分化成熟后，以外源性ADMA处理，检测无胰岛素刺激的基础状态及胰岛素诱导状态下2-脱氧-D-[3H]葡萄糖（2-DG）的摄取率（液闪计数仪），基础状态下胰岛素受体底物1（IRS-1）、葡萄糖转运体4（GLUT4）mRNA的表达，以及胰岛素诱导下IRS-1磷酸化水平（免疫沉淀与免疫印迹）与GLUT4转位（免疫印迹）变化。 （2）检测ADMA处理后NO、ROS、肿瘤坏死因子（TNF-α）的生成（ELISA法）以及Toll样受体4（TLR4）mRNA的表达；在此基础上，进一步观察左旋精氨酸、TLR4封闭抗体以及抗氧化剂维生素E能否对抗ADMA的作用。 研究结果 （1）外源性应用ADMA（3，10μM）处理48小时可显著降低基础及胰岛素诱导状态下成熟3T3-L1脂肪细胞对2-脱氧-D-[3H]葡萄糖的摄取。 （2）ADMA（3，10μM）可下调基础状态下IRS-1与GLUT4mRNA表达。ADMA处理还可下调胰岛素（lnM）诱导的磷酸化IRS-1蛋白含量与GLUT4蛋白表达，并抑制GLUT4从胞浆向胞膜转位。 （3）除了抑制NO生成外，ADMA10μM处理48小时可显著促进3T3-L1脂肪细胞内ROS与TNF-α生成，并且上调3T3-L1脂肪细胞中TLR4mRNA表达。应用TLR4封闭抗体10μg/ml预处理可对抗ADMA对葡萄糖摄取及TNF-α生成。 （4）维生素E30μM预处理可促进基础及胰岛素诱导下葡萄糖摄取，减弱ADMA对IRS-1、GLUT4的抑制作用并降低ROS、TNF-α及TLR4mRNA水平。维生素E还可上调正常细胞DDAH活性而降低ADMA含量。尽管L-arg可升高NO水平，但却对ROS、葡萄糖摄取率以及ADMA含量、DDAH活性无明显影响。 结论 ADMA可通过激活氧化应激/TLR4炎症通路而损害脂肪细胞对葡萄糖的糖利用并诱导胰岛素抵抗。

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引言

第一章ADMA对糖尿病红细胞变形能力的影响

1.1前言

1.2材料与方法

1.3结果

1.3.1不同病程糖尿病大鼠血糖与红细胞变形能力的变化

1.3.2不同病程糖尿病大鼠ADMA、NO、MDA的变化

1.3.3糖尿病离体血管环孵育红细胞对IEI的影响

1.3.4外源性ADMA处理对IEI、NO、MDA及ROS的影响

1.4讨论

1.5结论

第二章 脂肪细胞DDAH/ADMA系统与糖尿病胰岛素抵抗

2.1前言

2.2材料与方法

2.3结果

2.3.1胰岛素抵抗糖尿病模型鉴定

2.3.2糖尿病大鼠脂肪组织DDAH/ADMA系统的变化

2.3.3脂肪组织DDAH/ADMA系统与血糖及胰岛素敏感性之间存在关联。

2.3.4高糖处理对脂肪细胞中DDAH表达的影响

2.3.5脂肪细胞DDAH过表达对IRS-1与GLUT4表达的影响

2.4讨论

2.5结论

第三章 ADMA诱导脂肪细胞胰岛素抵抗及机制研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果

3.3.1 ADMA对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

3.3.2 ADMA对IRS-1与GLUT4的影响

3.3.3 ADMA的作用机制涉及氧化应激/TLR4途径

3.4讨论

3.5结论

参考文献

综述：ADMA与糖尿病的研究进展

致谢

个人简历

在读期间已发表的主要SCI论文