安徽小麦赤霉病菌菌群分布及产毒类型相关研究

摘要

小麦赤霉病(Wheatheadscab)是中国乃至世界小麦生产上的重要病害之一,本文以安徽省小麦产区所采集的小麦赤霉病菌为研究对象,着重从不同地区菌株菌群类型F.asiaticum和F.graninearumPCR-RFLP分子鉴定;菌群类型与前茬作物之间的关系;不同地区菌株产生毒素类型;探讨RealTime-PCR定量检测小麦赤霉病菌含量方法;主要研究结果如下:
　　1.安徽省小麦产区赤霉菌株的PCR-RFLP分子鉴定及分布图绘制
　　本文对2010-2013年期间采自安徽省小麦产区31个小麦赤霉病病穗进行了小麦赤霉病菌株分离纯化,同时对所有样品进行了DNA的提取[1]。样品分别来源于安徽北部地区:固镇、利辛、亳州市、毛集、凤台县、颍上县、阜阳市、蒙城县、太和县、涡阳县、怀远县、宿州市、砀山县;安徽中部地区:巢湖市、定远县、六安市、寿县、金寨县、霍邱县、长丰县、明光市、含山县、凤阳;安徽南部地区:宣州区、铜陵市、潜山县、怀宁县、安庆市、南陵县、繁昌县、芜湖市。
　　利用引物进行PCR扩增,最后利用限制性内切酶EcoiV和StyⅠ对PCR产物进行酶切。结果显示:在所有31株小麦赤霉菌株中,只有寿县、砀山、蒙城、安庆菌株为F.graninearum,剩余27地菌株均为F.asiaticum。表明安徽省菌群类型以F.asiaticum为主,同时也有F.graninearum,但F.graninearum主要分布在皖北部地区。
　　2.小麦赤霉病菌种群类型与前茬作物旱作水作(水稻、玉米)关系
　　本试验采用大样本采样,前茬作物玉米的采样点:蒙城县、颍上十里铺、颍上西三十里铺、颍上六十里铺;前茬作物水稻的采样点:怀远县、颍上县。各采样点均分离、纯化30个小麦赤霉菌菌株,共180个菌株。利用特异性引物进行PCR扩增,最后用限制性内切酶EcoiV和StyⅠ对PCR产物进行酶切。结果显示:前茬作物为玉米的四个采样点,分离的120个小麦赤霉菌菌株中出现17株F.graninearum,剩余全部为F.asiaticum。F.graninearum菌株的检出率为14.2％;前茬作物为水稻的两个采样点,分离的60个小麦赤霉菌菌株中出现3株F.graninearum,剩余全部为F.asiaticum。F.graninearum菌株的检出率仅为3.3%。从试验结果可以看出,在相似生态区域内,前茬作物对小麦赤霉菌菌群分布有较大影响,前茬作物为玉米的F.graninearum检出率较高。
　　3.安徽省小麦产区小麦赤霉产单端孢霉烯族毒素类型分三种,NIV、DON(3-DON、15-DON)PCR-RFLP分子鉴定
　　本文对2010-2013年期间采自安徽省小麦产区31个小麦赤霉病病穗进行了小麦赤霉病菌株分离纯化,同时对所有样品进行了DNA的提取。
　　利用引物对1:上游ToxP1(5’-GCCGTGGGRTAAAAGTCAAA-3’)下游ToxP2(5’-TGACAAGTCCGGTCGCACTAGC-3’)
　　该引物对以小麦赤霉病菌DNA为模板进行PCR扩增,得到相应产物片段大小为360bp可判断该菌株产生毒素类型为NIV.片段大小为300bp可判断该菌株产生毒素类型为DON。具体为3-DON还是15-DON利用引物2,3分别判断。
　　引物对2上游Tri303F(5’-GATGGCCGCAAGTGGA-3’)下游Tri303R(5’-GCCGGACTGCCCTATTG-3’)引物对3上游Tri315F(5’-CTCGCTGAAGTTGGACGTAA-3’)下游Tri315R(5’-GTCTATGCTCTCAACGGACAAC-3’)
　　利用引物对2,3分别对小麦赤霉病菌DNA进行PCR扩增,只能扩增出586bp大小片段的菌株可判断该菌株产生毒素类型为3-DON,只能扩增出864bp大小片段的菌株可判断产生毒素类型为15-DON。
　　结果表明:芜湖,潜山县,巢湖市,霍邱县,太和县,铜陵地区菌株样品产毒素类型为NIV,蒙城县,砀山县,寿县,安庆菌株产毒素类型为15-DON,剩余各县样品产毒类型均为3-DON。发现凡产毒素类型为15-DON的菌株在菌群分类检测中均为F.graninearum。
　　4.RT-PCR检测小麦赤霉病菌DNA含量标准曲线制作
　　试验利用CTAB法提取小麦赤霉病菌菌株DNA作为模板。选取Tri5基因中特异引物:Tri5F5'-AGCGACTACAGGCTTCCCTC-3'Tri5R5'-AAACCATCCAGTTCTCCATCTG-3'
　　首先进行普通PCR获得500bp大小产物,利用天根胶回收试剂盒进行胶回收。采用核酸浓度测定仪(Thermal)测取浓度3.5ng/ul。随后将回收后的DNA作为模板进行梯度稀释,浓度梯度为10,稀释10000倍。之后,按照SYBR?PriemixExTaqTMII(TliRNaseHPlus,TaKaRa)建议体系加入染料和荧光定量PCR反应试剂进行荧光定量PCR,获得标准曲线方程:y=-4.6953lg(x)+6.4496R2=0.9982。
　　5.南陵赤霉菌株的鉴定及相关生长特性研究
　　研究过程中发现一株菌落表型特异菌株,于是对该菌株进行了ITS及PCR-RFLP分子鉴定,并同常见菌株进行了相关生物特性的比较。通过分子生物学方法分别鉴定了其种属类别。测定了其菌丝生长速率,产色素量与产色素速度,产孢量与产孢速度及其致病力,同时完成该菌株与其他常见菌株的上述各测定量的对比。真菌ITS鉴定与PCR-RFLP鉴定结果表明该菌株确定为Fusariumasiaticum无疑,各测定指数如菌丝生长速率,产孢量,致病力等均低于常见赤霉病菌株。

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1文献综述

1.1小麦赤霉病的分布与危害

1.2 小麦赤霉病研究概况

2引言

3材料与方法

3.1安徽省小麦赤霉病菌的PCR-RFLP分子鉴定及分布图绘制。

3.2小麦赤霉菌菌群分布与前茬作物旱作水作（水稻、玉米）的关系

3.3安徽省小麦赤霉产单端孢霉烯族毒素类型分子鉴定

3.4 RT-PCR检测小麦赤霉病菌含量曲线制作

3.5南陵赤霉菌株的鉴定及相关生长特性研究

4试验结果与分析

4.1安徽省小麦赤霉菌菌群分布

4.2小麦赤霉病原菌菌群分布与前茬作物（旱作水作）的关系分析

4.3安徽小麦赤霉产单端孢霉烯族毒素类型分子鉴定

4.4 RT-PCR法检测小麦赤霉菌含量的探讨

4.5南陵赤霉菌菌株的鉴定及相关生长特性研究

5 讨 论

5.1 安徽省小麦赤霉菌菌株PCR-RFLP分子鉴定及分布图绘制。

5.2小麦赤霉菌菌群分布与前茬作物旱作水作（水稻玉米）的关系

5.3安徽省小麦赤霉产单端孢霉烯族毒素类型分子鉴定

5.4 RT-PCR检测小麦赤霉病菌含量曲线制作

5.5南陵赤霉菌株的鉴定及相关生长特性研究

6 结论

参考文献

致谢

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