致病性鸭源奈瑟菌的分离鉴定及生物学特征研究

摘要

2012年4月,安徽省部分规模化鸭场爆发一种以鸭眼部肿胀、眼睑分泌物增多、眼结膜粘合以致失明的急性传染病。该病传播速度极快,一旦少数鸭发病,1~2天便会扩散至全群。该病发病率较高,但死淘率较低,约在5％左右。此外,因患病鸭常发生单目或双目失明,无法自主采食,导致淘汰率较高,给当地养鸭业造成了较为严重的经济损失。
　　本研究从安徽地区鸭场患病鸭分离2株革兰氏阴性球菌,对其形态学观察、培养特性、生化试验及16SrRNA序列分析等进行鉴定。电镜下观察分离菌呈卵圆形或肾形,菌体长约0.5-0.7μm,宽为0.5μm,呈典型奈瑟菌形态。分离菌在巧克力平板生长呈灰白色,光滑,圆润的菌落;生化试验表明分离菌氧化酶、触酶和吲哚阳性,葡糖糖发酵阳性,蔗糖、果糖、木糖、枸橼酸盐等呈阴性反应,其16SrRNA基因序列与奈瑟菌属细菌同源性最高可达到99%。初步鉴定为奈瑟菌属细菌,并分别命名为AH-N10株和XC株。根据奈瑟菌asd基因序列保守区设计引物,用于检测鸭源奈瑟菌。经特异性试验,敏感性试验,表明所建立的PCR检测方法稳定有效,敏感性较高,可用于临床快速检测鸭源奈瑟菌。
　　为进一步了解鸭源奈瑟菌的生物学特性,对其亲缘性、生长培养特性、保存方式、致病性等方面进行研究。对分离菌株的16SrRNA测序分析后,构建了分离菌株基于奈瑟菌属不同菌种的16SrRNA系统进化树,分析其同源性。结果表明分离菌株处于奈瑟菌属进化分枝内,与黄色奈瑟菌、粘液奈瑟菌同源性较高。分离菌株在含5%胎牛血清的液体培养基中8小时达到稳定期,20小时开始进入衰亡期,稳定期细菌含量达到109cfu/mL。应用甘油保存法、脱脂牛奶保存法以及冷冻干燥保存法对分离菌进行保存效果试验,表明甘油保存法不适用于对鸭源奈瑟菌的保存,保存的细菌会失去活性无法复苏;脱脂牛奶保存法和冷冻干燥保存法均能达到良好的保存效果,复苏后细菌形态等特性未发生变化。
　　通过其对雏鸭及小鼠的感染试验表明腿部肌肉注射108cfu分离菌,雏鸭会出现与临床病鸭一致的临床及剖检病变,死亡率达到30%左右。分离菌通过腹腔注射至小鼠体内,亦会出现明显眼病病征按寇氏法测定2株鸭源奈瑟菌株的半数死亡量(LD50)分别为3.47×108,3.40×108。
　　药物敏感性试验表明两分离菌株对青霉素、喹诺酮类药物普遍耐药,对氨基糖苷类及氯霉素类药物较为敏感。应用中药白头翁,黄连,黄岑,黄柏,石榴皮,诃子,白芍,杖子,荆芥炭等制备了中药方剂。通过中药复方对鸭源奈瑟菌的体外抑菌试验和治疗试验分析其抑菌及治疗效果。结果表明,该中药复方对鸭奈瑟菌的液体培养及法MIC为0.25g/mL;固体培养基法药液浓度最低为0.005g/mL,具有抑菌作用;中药复方对鸭奈瑟菌抑菌圈直径为16mm。治疗试验表明中药复方可明显缓解对发病雏鸭病征,降低死亡率,治愈率达到90%。结果表明该复方对鸭源奈瑟菌具有良好的抑菌及治疗效果。

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文 献 综 述

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2引物设计

2.3鸭源奈瑟菌感染病鸭的剖检及PCR病毒排除法鉴定

2.4鸭源奈瑟菌细菌培养

2.5鸭源奈瑟菌形态学检查

2.6鸭源奈瑟菌生化试验

2.7 鸭源奈瑟菌保存

2.8 鸭源奈瑟菌16S rRNA基因检测

2.9 鸭源奈瑟菌PCR方法建立

3 结 果

3.1 鸭源奈瑟菌感染病鸭临床观察、剖检及病毒PCR方法排除

3.2 鸭源奈瑟菌细菌培养

3.3 鸭源奈瑟菌形态观察

3.4 鸭源奈瑟菌生化试验

3.5 鸭源奈瑟菌保存

3.6 16S rRNA基因检测

3.7 鸭源奈瑟菌asd基因PCR方法的建立

3.8 鸭源奈瑟菌药敏试验

3.9 鸭源奈瑟菌生长曲线测定

4 讨 论

4.1鸭源奈瑟菌引发鸭传染性眼睑炎的流行病学

4.2 鸭源奈瑟菌的鉴定

4.3 鸭源奈瑟菌的保存

4.5鸭源奈瑟菌可能的致病机理

4.6鸭源奈瑟菌的防治

结 论

参考文献

致谢

作者简介

研究生期间发表的论文