昆虫细胞表达重组H5亚型禽流感HA蛋白及其免疫原性研究

摘要

H5N1亚型高致病性禽流感不仅给养殖业带来了严重的危害，而且威胁人类健康与公共卫生安全。灭活疫苗免疫是目前防控禽流感的有效措施之一，但灭活苗候选株的筛选耗时费力，且疫苗生产过程涉及活病毒，存在生物安全隐患，并受鸡胚供应的限制。禽流感血凝素（Hemagglutinin，HA）亚单位疫苗可以避免灭活苗的缺点，HA蛋白是禽流感病毒主要表面抗原，具有刺激机体产生中和抗体的作用，是研发亚单位疫苗的主要靶标蛋白。其他研究表明杆状病毒表达系统表达的HA+M1蛋白，其生物学活性、抗原性和免疫原性方面与天然HA蛋白极为相似，但是目前关于杆状病毒表达系统表达HA蛋白，其生物学活性、抗原性和免疫原性方面报道相对较少。因此，本研究利用杆状病毒表达系统表达H5亚型禽流感HA蛋白，并对该重组蛋白的血凝活性、VLP（Virus-like particle, VLP）组装、免疫原性等进行研究。
　　构建含HA基因的克隆载体。两种途径获得HA基因。用RT-PCR方法从禽流感（H5亚型，Re-6株）检测抗原中扩增HA基因，命名为L。另根据GenBank中HA基因进行比对分析，选取HA基因序列，命名为H。再根据昆虫细胞的密码子偏嗜性进行优化，合成上述目的基因。以合成的含HA基因的质粒（HHAc-T和LHAc-T）为模板，经PCR扩增、克隆获得包含信号肽和跨膜区（1,857 bp）以及不含信号肽和跨膜区（1,701 bp）的HA基因，与pMD19-T克隆质粒连接构建重组克隆质粒H-NSTHA-19T、H-HA-19T、L-NSTHA-19T和L-HA-19T。
　　构建含HA基因的杆状病毒重组表达载体和鉴定重组蛋白。将目的基因从pMD19-T克隆载体，经EcoRⅠ和HindⅢ酶切插入pFastBac1质粒（pF-H-HA、pF-H-NSTHA、pF-L-HA和pF-L-NSTHA）。再将上述质粒转染至DH10Bac感受态细胞，经过三次蓝/白斑筛选获得重组rBacmid（rBac-H-HA、rBac-H-NSTHA、rBac-L-HA、rBac-L-NSTHA）。用rBacmid转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，收集感染96 h后病变细胞的裂解上清。将表达上清液进行系列检测，包括血凝试验、SDS-PAGE、Western-blot和IFA，验证重组HA蛋白在Sf9细胞中能够大量可溶性表达，并且重组蛋白具有与灭活病毒抗原有相似的血凝活性及免疫原性。用透射电镜观察到重组HA蛋白在体外能够自行组装形成病毒样粒子。
　　鸡体中重组HA蛋白的免疫原性鉴定。通过动物免疫试验验证Sf9细胞表达的重组蛋白的免疫原性。以H-HA、L-HA重组蛋白配制成油乳剂疫苗免疫14日龄的SPF鸡。免疫后第14、21、28天翅下静脉采血，通过血凝抑制试验（HI）和ELISA试验检测抗体效价，结果表明免疫后的各组均能够刺激机体产生较高的抗体。在免疫后的第3、5、7、10天，经FCAS检测CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T淋巴细胞亚群的变化规律和淋巴细胞转化试验。结果表明，2个重组蛋白组鸡的CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T淋巴细胞亚群比例稍高于灭活疫苗组，淋巴细胞转化试验亦表明，2个重组蛋白组鸡的淋巴细胞转化效率略高于常规灭活疫苗组。以上结果表明，重组蛋白制备的疫苗能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，具有较好的免疫原性，综合效果略优于现有H5亚型禽流感灭活疫苗。
　　综上所述，虽然利用杆状病毒系统表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的血凝价有报道，但是重组HA蛋白的血凝价偏低。本研究利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中成功地表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白，且重组的HA蛋白有较高血凝价，同时该重组HA蛋白具有较好的免疫原性，为后续研发新型禽用H5亚型禽流感亚单位疫苗提供了理论依据及物质基础。

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文献综述

引言

1 材料与方法

1.1菌株与质粒等

1.2 主要试剂（盒）

1.3 溶液与培养基

1.4 PCR引物设计与合成

1.5 SDS-PAGE相关试剂

1.6 主要仪器

1.7 基因克隆及序列分析

1.8 H5N1亚型禽流感HA基因重组

1.9 重组杆状病毒表达质粒的构建

1.10 重组杆状病毒的制备和鉴定

1.11 重组杆状病毒表达蛋白分析

1.12 重组蛋白的免疫原性

2 结果与分析

2.1 禽流感HA基因的克隆及序列分析

2.2 H5亚型禽流感HA基因的重组

2.3 重组真核表达载体的构建

2.4重组杆状病毒的制备与鉴定

2.5重组蛋白在昆虫细胞上的表达

2.6 重组蛋白的免疫原性

3讨 论

3.1 高致病性禽流感H5N1 HA基因的设计

3.2 H5N1亚型禽流感重组HA蛋白在杆状病毒系统表达

3.3 重组HA蛋白免疫原性

结论

参考文献

致谢

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