调控特定基因的miRNAs的筛选方法建立与非编码RNA基因Z38的鉴定和功能研究

摘要

本研究分为二部分：　　第一部分：调控特定基因的miRNAs的筛选方法建立　　在哺乳动物和其它真核生物中，约98%的基因组序列都不编码蛋白质而是编码大量的非编码RNAs（non-codingRNAs，ncRNAs）。在ncRNAs中，miRNAs(microRNAs)自发现以来就一直备受研究者的关注，尤其是在2006年诺贝尔奖授予了与之相关的研究成果之后，miRNAs研究成为了最热门的研究之一。随着研究的深入，对于miRNAs的研究也由最开始的发现与鉴定新miRNAs转移到miRNAs的功能研究，现在已知miRNAs这些微小的RNAs控制着包括细胞增殖、凋亡、器官发生、发育、造血以及肿瘤发生等若干途径。研究miRNAs功能首要解决的两个问题是miRNAs下游靶基因的寻找和调控某一特定靶基因的miRNAs的寻找。对于miRNAs靶基因的寻找，原先采用的方法是软件预测然后实验验证的方法，但是软件预测并不能很好地反映细胞内的真实情况且实验验证工作量大，所以近一年来已经有文章报道通过实验方法直接来寻找miRNAs的靶基因并获得成功。而对于调控特定靶基因的miRNAs的寻找，目前还是以先软件预测再实验验证为主，所以我们的目的就是要寻找一种直接以实验为基础筛选和验证调控特定靶基因的miRNAs的方法。　　已有多篇文献报道miR-21通过直接结合程序性细胞死亡蛋白4(PDCD4)3'端非翻译区(UTR)来调控PDCD4。所以我们用miR-21和PDCD4为模型来建立实验方法。首先将PDCD43'UTR克隆到pEGFP-C1质粒并与Ago(Argonaute)蛋白表达质粒共转染HeLa细胞；然后设计三段针对EGFPmRNA的生物素(biotin)标记反义链DNA，将反义链混合物与上述HeLa细胞裂解物共孵育；再通过链霉亲和素(streptavidin)偶联琼脂糖凝珠亲和沉淀(pull-down)biotin标记的反义链把EGFP-PDCD43'UTRmRNA及所结合的miRNAs间接沉淀下来。通过Trizol提取RNA并用miRNAs反转录试剂盒反转录，以反转录产物为模板用针对miR-21的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，这样我们成功检测到了miR-21的存在。建立了通过实验直接分离筛选调控特定靶基因miRNAs的方法，为我们进一步研究miRNAs的功能奠定了基础。　　第二部分：非编码RNA基因Z38的鉴定和功能研究　　除了近年来发现的miRNAs和piRNAs等调控型小分子ncRNAs外，范围从300bp-1Okb不等的长片段ncRNAs在基因的转录和翻译、细胞分化和个体发育、遗传和表观遗传等生命活动中也发挥重要的组织和调控作用，形成了细胞中高度复杂的RNA网络。　　Z38基因是本实验室通过抑制消减杂交技术在小鼠乳腺癌中首先分离得到的一个高表达基因，在人中的同源基因编码大约2.7kb左右的转录本。目前已经知道Z38基因转录产物在人乳腺癌中高表达并具有促进细胞增殖，增强细胞活力的作用。抑制Z38基因的表达则会导致细胞活力下降甚至凋亡。为了进一步研究Z38基因，我们通过体外翻译、抗体合成、免疫荧光、亚细胞定位等试验证明了Z38基因转录产物是一个长片段ncRNA;同时通过荧光实时定量PCR实验检测了Z38基因在各种人癌组织和癌细胞系中的表达谱；设计并合成了Z38基因的siRNAs并证明了其可以干扰Z38基因的表达；通过对高表达Z38基因的MDA-MB-231乳腺癌细胞系成瘤裸鼠注射Z38siRNAs，我们发现注射Z38siRNAs可以抑制肿瘤生长。以上证据表明,Z38基因与乳腺癌的发生与生长密切相关，为我们进一步开展乳腺癌核酸药物的研究打下了基础。

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