茶树两个MYB转录因子基因的克隆及功能验证

摘要

在植物体内，苯丙烷代谢是一条重要的次生代谢，涉及到木质素、香豆酸酯类以及类黄酮等多种代谢产物的生成[1]。MYB转录因子，是植物中最大的转录因子家族之一，参与调控苯丙烷类代谢途径。
　　本研究克隆并分析了2个茶树中的第四亚组R2R3-MYB转录因子；利用qRT-PCR技术，分析了它们在不同器官不同处理下的基因表达特异性；为探讨它们对植物酚类物质合成代谢的调控作用，构建了真核表达载体，进行烟草和拟南芥的转化。
　　主要研究结果如下：
　　1．首先利用同源克隆的方法，从 NCBI和安徽农业大学茶树转录组筛选出可能涉及苯丙烷代谢途径调控的候选R2R3-MYB转录因子的EST序列。利用RACE技术，克隆并得到茶树两条候选R2R3-MYB转录因子的cDNA全长。
　　2．利用生物信息学分析发现，这两条 R2R3-MYB转录因子位于22个植物R2R3-MYB亚组中的第四亚组（C2阻遏物基因序列进化枝），分别命名为CsMYB4-5与CsMYB4-6，预测具有抑制酚类物质合成的调节功能。利用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对，发现CsMYB4-5氨基酸序列与金鱼草AmMYB330和拟南芥AtMYB3一致性分别为48.45％和44.79%；CsMYB4-6氨基酸序列与金鱼草AmMYB308和拟南芥AtMYB4一致性分别为69.80%和62.41%。
　　3．利用qRT-PCR技术，分别检测了两个基因在茶树的不同器官、不同的诱导条件、叶片不同的发育时期的表达差异。结果表明，CsMYB4-5和CsMYB4-6两个基因在根中表达量高，茎中表达量低；但是随着叶片伸展发育，两个基因的表达趋势并不完全相同；伤害处理、外源植物激素ABA和GA对CsMYB4-5与CsMYB4-6表达的影响并不大。
　　4．利用烟草遗传转化体系验证CsMYB4-5与CsMYB4-6转录因子的功能，结果显示，与野生型烟草相比较，转CsMYB4-5和CsMYB4-6转录因子烟草的生长均受到不同程度的阻碍，其中转CsMYB4-6转录因子对烟草生长的抑制更加明显。
　　不同转CsMYB4-6基因的烟草株系，随着CsMYB4-6转录因子表达水平的增加表型更显著。转CsMYB4-6转录因子烟草的表型表现在：植物矮小；叶片的叶脉紧缩而脉间凹凸不平，在成熟及衰老叶片上出现白色斑点（孤立的死细胞）；根系不发达，主根不明显；低表达的烟草株系其花色加深，而高表达的花色变浅。
　　再生过程中，转CsMYB4-6烟草愈伤发黄，长势明显低于野生型；第二代种子播种得到的烟草小苗相比于野生型二代小苗明显矮小、黄化、根系短。
　　显微观察，发现转CsMYB4-6烟草叶片腺毛明显变短，数量减少；叶片上下表皮之间细胞联系不紧密，出现空隙；间苯三酚染色观察，茎横切面红色变淡，表明木质素含量减少。
　　酚类物质含量检测发现，转 CsMYB4-6烟草叶片的木质素含量比对照下降了36.1%-44.4%，纤维素减少多达15.1%；高表达烟草株系的花中花青素含量下降47.7%，而低表达烟草株系花青素升高38.3%。
　　实时荧光定量PCR技术检测发现，转CsMYB4-6烟草叶片中涉及木质素生物合成途径的COMT、CCR、CAD、C4H、4CL基因表达下调，其中4CL基因下调幅度最大；在高表达转CsMYB4-6烟草花中涉及类黄酮生物合成途径中的PAL、C4H、CHS、CHI、DFR、LAR、ANR、ANS基因均下调，而在低表达烟草株系的花中却都上调。
　　5.利用拟南芥遗传转化体系验证CsMYB4-5与CsMYB4-6转录因子的功能，结果发现，在6-8叶幼苗时期，转CsMYB4-6基因的pap1幼苗生长受到明显抑制，叶色暗绿，叶片和茎的红紫色增加，花青素含量升高了115.0%。但是随着幼苗的长大，表型差异缩小。

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1 文献综述

1.1酚类物质合成代谢的研究

1.2 MYB转录因子的相关研究

1.3第四亚组R2R3-MYB转录因子的调控研究

2 引言

2.1 研究目的及意义

2.2 研究技术路线

2.3 研究主要内容

3 材料和方法

3.1 实验材料

3.2仪器与试剂

3.3试验方法

3.4烟草表达载体的构建

3.5转基因烟草的观察与检测

3.6 拟南芥的遗传转化

4 结果与分析

4.1 CsMYB4-5、CsMYB4-6基因cDNA全长克隆及生物信息学分析

4.2茶树器官表达特异性分析

4.3 CsMYB4-5、CsMYB4-6基因的烟草遗传转化试验

4.4 CsMYB4-5、CsMYB4-6在拟南芥中的转基因分析

5讨论

5.1 茶树CsMYB4-5和CsMYB4-6的表达差异

5.2第四亚组基因的功能

5.3第四亚组基因的调控机理

结论

参考文献

致谢

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