Ezrin在小鼠睾丸中的表达规律及在精子获能中的功能研究

摘要

Ezrin是连接细胞膜与细胞骨架的一种蛋白，在细胞膜重塑、细胞迁移、细胞增殖、细胞信号传导和细胞形态的维持等多种生命活动均起到重要调节作用。磷酸化修饰是调控ezrin活性最重要的机制。目前已鉴定的调节ezrin功能的磷酸化位点有7个。已有的研究表明睾丸内有ezrin表达，并参与了哺乳动物精子发生与获能等过程。但睾丸内ezrin表达有何规律？发生了哪些修饰？这些修饰又与精子发生及获能有何关系？目前尚无确切论断。
　　本试验以ICR鼠为研究对象，应用免疫荧光染色技术及荧光定量PCR技术对不同发育阶段的公鼠睾丸以及不同发育时期育精子ezrin的表达水平进行分析，总结其对小鼠精子发育尤其对精子获能产生影响的作用规律，为阐明ezrin对哺乳动物精子发生的分子机制奠定一定的基础。研究主要分为三部分：
　　1. Ezrin蛋白在小鼠睾丸中的定位
　　在小鼠生精的时间基础上，取1w龄（性成熟前）、7 w龄（性成熟）及17 w龄（成年期）公鼠的睾丸，进行间接免疫荧光染色及免疫组织化学染色，分析ezrin在小鼠睾丸内的定位规律，两者结果均显示：性成熟前ezrin主要定位于小鼠睾丸间质细胞，性成熟后ezrin不仅定位在间质细胞，生精小管内的精子细胞也有部分着色，到成年期，可以明显的看到生精小管内的着色加深，着色的区域范围更广。
　　2.小鼠睾丸中ezrin表达规律
　　分别从1w、7 w及17 w龄公鼠的睾丸提取总RNA进行反转录，应用荧光定量PCR技术分析小鼠不同性生理年龄睾丸内ezrin mRNA表达水平，结果显示：性成熟前小鼠睾丸ezrin mRNA的表达水平稍高于达性成熟后，随着年龄的增长，到达成年期ezrin mRNA的表达水平又逐渐升高。
　　3.小鼠附睾头内精子细胞中Ezrin蛋白的表达及修饰
　　取性成熟公鼠的附睾头，释放出精子细胞，经未获能及获能处理后，取适量涂与多聚赖氨酸处理的载玻片上，自然晾干，并固定后，分别以兔抗Ezrin多克隆抗体、p-Ezrin(Y354)及p-Ezrin(T567)抗体进行间接免疫荧光染色方法检测经获能处理前后Ezrin蛋白的表达及磷酸化修饰水平的变化，结果发现：附睾头内的精子有Ezrin蛋白的表达，且在获能前后Ezrin蛋白Y354及T567均发生了磷酸化修饰。
　　4.小鼠附睾尾内成熟精子中Ezrin蛋白的表达及修饰
　　取性成熟公鼠附睾尾，释放出精子，经获能及未获能处理后，取适量涂与多聚赖氨酸处理的载玻片上，自然晾干，并固定后，以间接免疫荧光染色方法，检测获能前后野生型及磷酸化型Ezrin蛋白表达水平的变化，结果发现：
　　（1）附睾尾内的精子有Ezrin蛋白的表达，且在精子获能后表达量下降；
　　（2）附睾尾内精子获能前后均有Ezrin蛋白发生Y354发生磷酸化修饰，且获能后Y354磷酸化修饰程度显著高于未获能组；
　　（3）附睾尾内精子获能前后均有Ezrin蛋白发生T567发生磷酸化修饰，且获能后T567磷酸化修饰程度显著高于未获能组.

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目录

文献综述

1精子发生与获能调控机制

1.1 精子的发生机制

1.2 精子发生的调控机制

1.3 精子获能的调控机制

2 Ezrin研究进展

2.1 ERM家族

2.2 FERM结构域

2.3 Ezrin蛋白的结构特点

2.4 Ezrin蛋白的组织分布与细胞定位

2.5 Ezrin蛋白的活化

2.6 Ezrin蛋白的生物学功能

2.7 Ezrin蛋白与肿瘤的相关分子调控机制

3 Ezrin蛋白在精子发生与获能中的功能研究进展

4 目前存在的问题及研究方向

引言

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物

1.1.2主要耗材

1.1.3 主要仪器

1.1.4 主要试剂与药品

1.1.5 溶液配制

1.2 试验方法

1.2.1 ezrin在小鼠睾丸中的定位

1.2.2 ezrin在小鼠睾丸中转录表达水平

1.2.3 RNA完整性的检测

1.2.4 总RNA反转录

1.2.5 引物的设计与合成

1.2.6荧光定量PCR

1.2.7 小鼠附睾头及附睾尾内精子获能及精子的间接免疫荧光染色

1.3试验设计

1.3.1 Ezrin在不同性生理年龄段小鼠睾丸中的表达定位

1.3.2 不同性生理年龄段小鼠睾丸ezrin mRNA转录水平的检测

1.3.3 小鼠附睾头精子获能前后Ezrin蛋白表达及磷酸化修饰分析

1.3.4 小鼠附睾尾精子获能前后Ezrin蛋白表达及磷酸化修饰分析

1.4数据分析

2 结果与分析

2.1 Ezrin蛋白在不同生理时期小鼠睾丸中的定位及表达规律

2.1.1 免疫荧光染色检测Ezrin在不同年龄段小鼠睾丸中的表达定位

2.1.2 免疫组化染色检测Ezrin蛋白在不同生理时期小鼠睾丸中的表达定位

2.1.3 ezrin mRNA在不同生理时期小鼠睾丸中的转录水平

2.2 附睾内精子细胞获能与未获能组中w-Ezrin及p-Ezrin蛋白的表达

2.2.1 附睾头内精子细胞获能前后w-Ezrin及p-Ezrin蛋白的表达

2.2.2 附睾尾内精子细胞获能前后w-Ezrin及p-Ezrin蛋白的表达

3 讨论

3.1 ezrin mRNA在小鼠睾丸中的转录水平

3.2 Ezrin蛋白在小鼠睾丸中的定位规律

3.3 Ezrin蛋白在小鼠精子获能过程中的作用

4 结论

参考文献

附录

致谢

个人简历